Иммуноферментный анализ. Иммуноферментный анализ (ИФА) является одним из наиболее бурно развивающихся в

Иммуноферментный анализ (ИФА) является одним из наиболее бурно развивающихся в настоящее время направлений прикладной иммунологии. В основе этого метода лежит присоединение к антителам ферментной метки, что позволяет учитывать результат реакции антиген-антитело по появлению ферментативной активности или по изменению ее уровня.

К сегодняшнему дню предложены десятки вариантов реакций, основанных на указанном принципе, но наиболее широкое распространение в диагностике инфекционных заболеваний получил твердофазный гетерогенный иммунный анализ – ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). Чаще всего для его осуществления применяют 96-луночные полистирольные планшеты, так как на полистироле можно легко адсорбировать антитела, а с помошью специальной обработки и различные антигены.

В случае применения ИФА для поиска антигена, на стенках лунок адсорбируют соответствующие антитела. Исследуемый материал вносят в лунку, при этом антиген, взаимодействуя с антителами, фиксируется в ней. Лунки тщательно промывают буферным раствором, чтобы удалить не адсорбировавшиеся вещества. Затем вносят антитела против искомого антигена, меченные ферментом. Чаще всего в качестве фермента-метки используют пероксидазу хрена. После инкубации лунку снова промывают, чтобы удалить избыток меченных антител, если они не удерживаются комплексом антиген-антитело, образовавшимся на предыдущем этапе. На заключительном этапе в лунки вносят хромогенный субстрат (например, о-фенилендиамин). Ферментативное расщепление субстрата приводит к образованию окрашенных продуктов реакции. Таким образом, изменение окраски содержимого лунки будет свидетельствовать о положительном результате реакции: взаимодействие антиген – антитело имело место.

При серодиагностике используются полистирольные планшеты, на стенках которых заранее с помощью тех или иных методов адсорбируется ("нагружается") антиген. Для предотвращения неспецифического связывания антител с полистиролом оставшаяся свободной поверхность полистирола подвергается специальной обработке. Исследуемая сыворотка вносится в лунку планшета. При этом гомологичные антигену антитела прикрепляются к нему. Не прикрепившиеся антитела удаляют промыванием. Затем в лунки вносят антитела против иммуноглобулинов (антител) человека, меченные ферментом. Если в исследуемой сыворотке присутствовали искомые антитела, то они на данном этапе выступят в роли антигенов, с которыми прореагируют меченные антитела. Добавление после промывки хромогенного субстрата позволит учесть реакцию по развивающемуся окрашиванию в лунках.

Планшеты, с нагруженными на их поверхность антигенами или антителами служат основой коммерческих диагностических наборов для иммуноферментного анализа. 96-луночные панели получили очень широкое распространение. Для работы в этом формате разработаны специальные многоканальные автоматические пипетки, позволяющие вносить реактивы одновременно в несколько лунок панели, а также автоматические и полуавтоматические устройства для промывания лунок. Существуют и специальные автоматы, позволяющие осуществить все этапы анализа практически без участия человека.

Несомненным преимуществом иммуноферментного анализа перед классическими иммунологическими реакциями (реакция агглютинации, РСК, РНГА) является возможность количественного анализа без использования серийных разведений. Интенсивность окраски в лунке пропорциональна количеству фермента, а следовательно количеству искомого ингредиента (антигена или антител). Измеряя оптическую плотность жидкости в лунке и сравнивая ее с контролем можно легко определить концентрацию искомого компонента. В этом случае для учета результатов используют специальные приборы "ридеры", представляющие по своей сути спектрофотометры с вертикальным ходом луча, специально приспособленные для работы со стандартными полистироловыми планшетами.

Использование 96-луночных планшетов экономически целесообразно при проведении массовых исследований в крупных иммунологических лабораториях. При единичных исследованиях такой формат невыгоден, поскольку частичное использование планшета не позволяет использовать многоканальные пипетки, промывающие устройства и другие приспособления, облегчающие проведение анализа. Кроме того, разведенные реагенты имеют ограниченный срок годности. Поэтому в последние годы все более широкое распространение получили планшеты, состоящие из "стрипов" – полосок по 8 или 12 лунок, собираемых в формат 96-луночного планшета в произвольном порядке. При этом можно или параллельно выявлять разные антигены (антитела) или задействовать только часть из 96 позиций. Однако «стрипованные» планшеты не решают проблему полностью, поскольку, как правило, реагенты разводятся в расчете на полный планшет (96 лунок).

Указанных недостатков лишена разновидность иммуноферментного анализа, получившая название dot-ELISA, примером которой являются тест-системы ImmunoComb ("Ordgenics", Израиль). В этом наборе антигены, необходимые для выявления антител в сыворотке больного, адсорбированы не в лунках, а на зубцах пластиковой гребенки. Для проведения исследования необходимо отломить необходимое количество зубцов, а исследуемые сыворотки внести в первый ряд лунок специальной панели, входящей в состав диагностического набора. Изначально лунки панели, содержащие все необходимые компоненты в готовом к употреблению виде, герметично закрыты фольгой. Прокалывая фольгу и последовательно перенося гребенку из одного ряда лунок в другой, мы проводим все этапы реакции. С помощью описываемой системы провести ИФА удается даже вне стен лаборатории при отсутствии высококвалифицированного персонала и дорогостоящего оборудования, а продолжительность исследования составляет от 45 мин до 1,5 час. Учет результата возможен также без применения специальных приборов, с помощью прилагаемой к набору цветной шкалы-компаратора. Еще одним несомненным достоинством описываемого диагностического набора является наличие системы внутреннего контроля.

Наиболее полно возможности ИФА раскрываются в случае применения для его постановки моноклональных антител. Это позволяет достигать высокой чувствительности в сочетании с исключительной специфичностью, по сравнению с другими серологическими реакциями.

Еще одним достоинством иммуноферментного анализа при серодиагностике является возможность определения классов специфических антител (IgG, IgM, IgA), что имеет значение при определении фазы инфекционного процесса и его остроты.

Дата добавления: 2015-09-06