ДНК-диагностика

В основе ДНК-диагностики лежит использование комплементарного связывания нуклеотидов. Известные в настоящее время реакции можно разделить на две большие группы. К первой группе относятся методы прямого обнаружения специфической последовательности нуклеотидов (ДНК или РНК) при помощи коротких олигонуклеотидных одноцепочечных фрагментов, имеющих репортерную группу (метку). Эти реакции получили название ДНК-зондирования или гибридизационного анализа. Их чувствительность зависит от вида используемой метки и может быть весьма высокой.

Таблица 31

Чувствительность гибридизационного анализа
при использовании различных меток

Тип метки	Чувствительность (Моль)
Хемилюминесцентная	10^-19
Радиоизотопная	10^-18
Флюоресцентная	10^-12
Ферментная	10^-9

Вторая группа методов основана на амплификации – циклически повторяющейся репликации in vitro искомого фрагмента ДНК (РНК). Амплифицированный фрагмент затем выявляется путем электрофореза в геле или с использованием гибридизационного анализа.

Полимеразная цепная реакция, первая из данной группы, была разработана сотрудником фирмы “Cetus” К.Муллисом в 1985 году [83]. В 1993 году автору присуждена Нобелевская премия в области химии. В настоящее время разработано много модификаций этой реакции, а также амплификационные тесты, принципиально отличающиеся от ПЦР (лигазная цепная реакция, амплификация, опосредованная через транскрипцию), однако именно полимеразная цепная реакция наиболее широко используется для диагностики различных форм инфекционной патологии [40].

В основе ПЦР лежат следующие свойства нуклеиновых кислот:

При нагреве до температуры 94-95 ⁰С происходит денатурация ДНК – образование однонитевых фрагментов.

Охдаждение до температуры 55-65 ⁰С приводит к связыванию комплементарных участков ДНК.

Для достройки комплементарной цепи ДНК при помощи ДНК-полимеразы необходимо наличие короткого двухцепочечного участка - "затравки". При постановке ПЦР в роли затравки выступают "праймеры" – короткие цепочки в 20-30 пар нуклеотидов, комплементарные определенным участкм искомой ДНК.

ДНК-полимераза производит достройку комплементарной цепи только в одном направлении – со стороны 3’- конца.

В состав диагностического набора для ПЦР входят праймеры, фланкирующие на разных цепях ДНК искомую последовательность (ампликон), ДНК-полимераза, нуклеотиды и буферные растворы.

Полимеразная цепная реакция, как и другие амплификационные тесты состоит из трех этапов:

выделение ДНК из пробы;

амплификация;

детекция.

Выделение ДНК. В качестве исследуемого материала для ПЦР могут быть использованы: соскоб со слизистых, кровь, ликвор, слюна, мокрота, моча, биоптаты и т.д. Пробоподготовка заключается в разрушении клеток и выделении нуклеиновых кислот. В простейшем случае эта задача может быть решена использованием специальных лизирующих растворов. Клеточные обломки осаждают центрифугированием, а надосадочную жидкость используют для постановки реакции. При исследовании соскобов такой способ может оказаться вполне достаточным для получения хороших результатов. Однако, в пробах может содержаться большое количество ингибиторов ДНК-полимеразы (гемоглобин, белок, гормоны), поэтому широкое применение находят методы, основанные на разрушении клеток и последующей сорбции ДНК. В дальнейшем после нескольких отмывок ДНК десорбируют и используют для постановки реакции. В качестве сорбентов применяют микропористое стекло, модифицированную целлюлозу, оксид кремния, инфузорную землю и др.

Амплификация. Для проведения амплификации готовят реакционную смесь («супермикст», «мастермикст»), содержащую праймеры, смесь дезоксирибонуклеотрифосфатов (дНТФ) и термостабильную ДНК-полимеразу. Буфер специального состава создает необходимую величину рН, оптимальную концентрацию ионов (в первую очередь Mg²⁺). В настоящее время, как правило, реакцию проводят в объеме 25 – 50 мкл, при этом объем пробы составляет 5 – 10 мкл.

В процессе амплификации реакционные пробирки нагреваются и охлаждаются в программируемом термостате («термоциклере», «амплификаторе»). При этом может происходить испарение жидкости, приводящее к изменению концентрации реагентов. Для предупреждения этого на реакционную смесь в пробирках наслаивают минеральное масло или используют термоциклеры с подогреваемой крышкой.

Процесс амплификации при проведении ПЦР состоит из трех циклически повторяющихся этапов:

денатурация или "плавление" ДНК, во время которого двухцепочечная молекула нуклеиновой кислоты разделяется на две цепи;

отжиг праймеров – присоединение праймеров к комплементарным участкам ДНК-мишени;

элонгация, то есть достраивание ДНК с помощью ДНК-полимеразы.

При нагреве пробирок до 94-95 ⁰С происходит «плавление» ДНК, приводящее к образованию однонитевых фрагментов. При снижении температуры до 55-65 ⁰С начинается присоединение праймеров к комплементарным участкам. Температура отжига зависит от структуры праймеров и может быть рассчитана по специальной формуле или определена эмпирически. Правильный выбор температуры отжига влияет на специфичность связывания. Третий этап реакции протекает при температуре 72 ⁰С. При этой температуре ДНК-полимераза осуществляет комплементарное достраивание со стороны 3’- конца праймеров.

Первые два цикла реакции являются подготовительными. При этом, благодаря однонаправленному синтезу, праймеры «вырезают» амплифицируемую последовательность и в последующем происходит репликация именно этого фрагмента. Как правило, проводят 30 – 40 циклов амплификации.

Детекция. Наиболее часто для выявления амплифицированных фрагментов используют электрофорез в агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Использование гибридизации на этом этапе позволяет повысить специфичность исследования.

Основными достоинствами полимеразной цепной реакции являются ее универсальность, высокая чувствительность и специфичность [12].

Универсальность ПЦР подразумевает возможность выявления различных возбудителей в одной пробе при помощи однотипной процедуры и на одном и том же оборудовании.

Теоретически чувствительность полимеразной цепной реакции может достигать 1-5 геномов на пробу. Однако диагностическая чувствительность этой реакции, по-видимому, на 1 – 2 порядка ниже. Она зависит от ряда факторов: интенсивности инфекционного процесса; правильности взятия и транспортировки материала; эффективности системы выделения ДНК, эффективности амплификации, системы детекции и др. Из перечисленных факторов одним из наиболее важных является процесс пробоподготовки. При длительной транспортировке пробы в лабораторию начинается аутолиз клеток и последующее разрушение ДНК эндонуклеазами. Содержащиеся в пробе ингибиторы ДНК-полимеразы также снижают чувствительность реакции, а использование нуклосорбертов в процессе выделения с одной стороны позволяет получить более очищенный препарат ДНК, а с другой – может также приводить к снижению чувствительности, вследствие потери части ДНК в процессе сорбции-десорбции.

Высокая специфичность реакции заложена в самом принципе ПЦР. Однако, в зависимости от поставленных задач можно варьировать этим показателем, создавая тест-системы, позволяющие обнаруживать родо-, видо- и типоспецифические последовательности. Так, при индикации в объектах окружающей среды сальмонелл целесообразно использовать родоспецифические праймеры, а при выявлении вируса папиломы – типоспецифические, для однаружения высокоонкогенных серотипов (16, 18, 33 и др.) [15].

Ни высокая чувствительность, ни высокая специфичность реакции не гарантируют от получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Причиной ложноотрицательного результата может явиться присутствие в пробе ингибиторов реакции. В современных тест-системах имеющих внутренний контроль такой ложноотрицательный результат легко выявляется. Другой причиной может явиться неэффективность системы пробоподготовки, связанная с плохим лизированием клеток, потерей ДНК на сорбенте и т.д. Такие ложноотрицательные результаты, как правило, выявить не удается.

Причиной ложноположительного результата является загрязнение пробы или реактивов специфической ДНК (ДНК из положительной пробы, амплификат, контрольная ДНК). Загрязнение может носить тотальный или гнездный характер.

При тотальном загрязнении, как правило, происходит контаминация компонентов диагностического набора. Это загрязнение приводит к существенным материальным потерям, но достаточно легко выявляется и предупреждается. Для предупреждения тотального загрязнения необходимо неукоснительное соблюдение принципов зонирования и поточности, использование ламинарных боксов, применение одноразовых инструментов, своевременное техническое обслуживание оборудования и вентиляции и т.д. Весьма оригинальное решение, предотвращающее загрязнение амплификатом, используется в диагностических наборах фирмы «Hoffman-LaRoshe» [15]. В тест-системах этой фирмы при проведении амплификации вместо тимина с дезоксирибозой связывается урацил. В состав реакционной смеси входит особый фермент N-урацилгликозилаза, с работы которого начинается первый цикл амплификации. Поскольку урацил не входит в состав нормальной ДНК N-урацилгликозилаза разрушает только синтезированные ранее копии, которые могли загрязнить реакционную смесь, при этом нативная ДНК не повреждается. При первом нагреве этот фермент инактивируется и дальше реакция идет по классической схеме.

Гнездное загрязнение возникает, как правило, при обработке проб и выделении ДНК. Возникающий при этом аэрозоль, контаминированные пипетки, руки персонала являются наиболее важными факторами такого загрязнения, выявить которое практически невозможно.

Таким образом, являясь одним из наиболее перспективных подходов к диагностике инфекционного процесса, генная диагностика не гарантирует от ложноположительных и ложноотрицательных результатов, а полученные с её помощью данные нуждаются в клинической трактовке.

Дата добавления: 2015-09-06