Принципы идентификации микроорганизмов

Основным условием правильной идентификации микроорганизмов, вне зависимости от используемого при этом метода, является наличие чистой культуры [49]. В связи с этим отколу колонии и последующей макро- и микроскопической проверке чистоты культуры необходимо уделять особое внимание. Следует избегать «откола» сразу нескольких колоний даже при их кажущейся однотипности. Желательно использовать петлю с маленькой головкой или иглу. Не рекомендуется охлаждать петлю, прикасаясь к питательной среде без признаков роста.

В отдельных случаях даже откол отдельно лежащей колонии не гарантирует получения в последующем чистой культуры. Например, колонии слизеобразующих бактерий могут содержать клетки других микроорганизмов, захваченные вместе со слизью. Культуры актиномицетов и представителей рода Bacillus могут иметь контаминанты в полостях между цепочками клеток. При раннем отборе колоний с селективной среды загрязнение может быть связано с захватом контаминантов, находящихся в подавленном, но жизнеспособном состоянии. Даже на неселективных средах откол не следует проводить слишком рано, в связи с возможным наличием медленно растущих микроорганизмов.

Работа по идентификации бактерий начинается еще до выделения чистой культуры - с изучения культуральных свойств, то есть характера роста микроорганизмов на питательной среде. Культуральные свойства бактерий выращенных на плотной питательной среде включают: форму, размер колоний, наличие пигмента, способность к росту при определенной температуре и концентрации углекислого газа и кислорода, на среде определенного состава и т.д. Кроме культуральных свойств еще до выделения чистой культуры иногда могут быть определены морфологические, тинкториальные свойства (например, путем микроскопии мазка из колонии, окрашенного по Граму), некоторые биохимические свойства (например, наличие ферментов оксидазы, каталазы), антигенные свойства (например, с помощью реакции агглютинации или реакции иммунофлуоресценции) и некоторые другие признаки. В отдельных случаях этого бывает достаточно для выдачи предварительного ответа о виде обнаруженного микроорганизма, но чаще всего изучение указанных признаков позволяет лишь наметить путь дальнейших исследований, которые уже выполняются с чистой культурой.

Решающее значение при идентификации большинства видов микроорганизмов имеет изучение их ферментативной активности. В классическом варианте для этой цели используют набор дифференциально-диагно­стических сред [41]. Однако в последние годы все чаще для идентификации бактерий используют коммерческие идентификационные системы, приме­нение которых позволяет не только повысить точность за счет увеличения числа тестов, но и сократить время исследования [81].

Выявление ферментативной активности основано на одном из пяти феноменов:

Реакции на основе изменения pH. На этом принципе основаны многие тесты, результат которых учитывается через 18-24 час. Рост микроорганизмов на питательной среде сопровождается ферментацией содержащихся в ней субстратов. Расщепление углеводов сопровождается накоплением кислых продуктов, в то время как утилизация белковых веществ, как правило, приводит к защелачиванию среды.

Реакции за счет конститутивных (предсинтезированных) ферментов. Такого рода реакции лежат в основе рапид-систем. Этот же принцип заложен в системах идентификации медленно растущих микроорганизмов или микроорганизмов, требующих особых условий культивирования (например, анаэробы в таких тест-системах могут быть идентифицированы без создания анаэробных условий инкубации). Как правило, такие тесты основаны не на изменении pH, а на использовании хромогенных или флюорогенных субстратов.

Использование меченых источников углерода. Этот метод с использованием меченых тетразолием или радиоактивным углеродом соединений позволяет получить ответ в короткие сроки (до появления видимого роста).

Выявление летучих и нелетучих кислот. Метод основан на выявлении конечных продуктов метаболизма в жидкой культуре при помощи газо-жидкостной хроматографии. Компьютерный анализ результатов и их сравнение с библиотечными данными позволяют осуществить идентификацию культуры.

Визуальное выявление роста. Этот метод используется в системах идентификации грибов и бактерий. Метод основан на выявлении способности микроорганизма к ассимиляции субстрата. Появление помутнения расценивается как положительный результат.

Иногда могут быть использованы дополнительные тесты, основанные на других принципах.

Существует несколько подходов к идентификации микроорганизмов. Традиционный, сложившийся еще в начале века, способ предусматривал постепенное приближение к ответу по ветвям дихотомического информационного дерева.

Дихотомический ключ для идентификации листерий [89].

При таком подходе используется ограниченное количество пробирочных (чашечных) тестов. Одни и те же тесты могут использоваться неоднократно на разных ветвях информационного дерева.

Очень важным при таком подходе оказывается ранжирование тестов по их значимости и выбор «ключевых» тестов. Это связано со следующими обстоятельствами:

Изучаемый признак должен встречаться (или отсутствовать) у всех штаммов данного вида, т.е. в 100% случаев. В противном случае атипичные по этому признаку штаммы никогда не будут правильно идентифицированы.

Воспроизводимость всех тестов должна приближаться к 100%.

Традиционная клиническая микробиология, базировавшаяся на указанных выше принципах, была не только трудоемкой и материалоемкой, но и требовала высокой квалификации персонала [81].

Вторая система идентификации, построенная на принципах нумерической (числовой) таксономии получила широкое распространение с начала 70-х годов. Основные ее положения были разработаны еще в 50-е годы. Прорыв в развитии вычислительной техники и особенно появление в конце 70-х персональных компьютеров, а также разработка коммерческих тест-систем позволили реализовать эти положения на уровне практических лабораторий.

Нумерическая таксономия базируется на следующих принципах:

Необходимо изучить максимально возможное количество признаков (в современных коммерческих тест-системах их количество колеблется от 12 до 25-30);

Все изучаемые признаки имеют равный вес;

Результат идентификации выглядит как коэффициент соответствия свойств выделенной культуры свойствам эталонных штаммов.

Использование указанных принципов и кластерного анализа при изучении коллекций культур позволяет проследить идущие эволюционные процессы и появление новых таксонов. Так Staphylococcus lugdunensis был открыт благодаря использованию тест-системы API (bioMerieux, Франция).

Характеристика некоторых тест-систем для биохимической идентификации бактерий представлена в таблице 29. Существует два основных типа таких систем. Наиболее широкое распространение получили индивидуальные системы, расчитанные на идентификацию одной культуры. К ним относятся отечественные тест-ситемы ПБДЭ, ПБДС (НПО «Диагностические системы», г. Н.Новгород), семейство систем API (BioMerieux, Франция) и многие другие. Второй тип систем идентификации основан на использовании многорядных планшетов, в которых каждый ряд лунок позволяет идентифицировать одну культуру. Как правило, используются стандартные 96-луночные полистироловые планшеты аналогичные тем, что применяются в иммуноферментном анализе. К системам этого типа относятся наиболее широко распространенные в нашей стране тест-системы фирмы Lachema (Чехия), а также идентификационные наборы ММТ Е (НПО «Аллерген», г. Ставрополь). Для небольших и средних лабораторий более удобны индивидуальные тест-системы. Попытки использовать панели на 8-12 культур в несколько приемов могут стать причиной дополнительных ошибок, так как при термостатировании происходят изменения в неиспользуемых лунках.

Идентификация выделенной культуры состоит из следующих этапов:

приготовление суспензии и инокуляции лунок;

инкубация;

учет результатов тестов;

интерпретация результатов.

Для приготовления суспензии, как правило, используется стерильный изотонический раствор, однако в некоторых случаях необходимо использовать специальные буферы или инокуляционные среды, входящие в состав набора. Концентрация микроорганизмов в суспензии определяется по оптическому стандарту мутности. В международной практике используется шкала McFarland, в нашей стране – оптические стандарты мутности, производства Российского Государственного института медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича. Неправильное приготовление суспензии (слишком высокая или наоборот низкая концентрация микроорганизмов, использование старой культуры и т.д.) может явиться причиной неправильного срабатывания системы.

В зависимости от конструктивных особенностей диагностического набора для инокуляции могут быть использованы градуированные пипетки, микродозаторы, пастеровские пипетки. В некоторых тест-системах инокуляция осуществляется методом погружения (“Crystal”) или при помощи специального инокулирующего стержня (“Enterotube II”).

Инкубация тест-систем проводится в обычных термостатах или в специальных термостатируемых устройствах, входящих в комплект некоторых автоматизированных систем идентификации (“Vitek”, bioMerieux, Франция). При идентификации анаэробных микроорганизмов, обычно, требуется создание безкислородной атмосферы, однако некоторые системы, основанные на выявлении предсинтезированных ферментов, инкубируются в аэробных условиях. Температура и время инкубации, указанные в инструкции фирмы-изготовителя должны выдерживаться максимально точно. Несоблюдение этих параметров является одной из наиболее частых причин неправильной идентификации культуры.

Таблица 29

Системы биохимической идентификации бактерий

Идентифици-руемые микро-организмы	Тест- система	Количество тестов	Время инкубации, час	Фирма-производитель
Энтеро-бактерии	ПБДЭ		18-24	НПО «Диагностические системы», Н.Новгород
ММТ Е-1, ММТ Е-2	24 (12+12)		НПО «Аллерген», г. Ставрополь
Enterotube II		18-24	Becton Dickinson, США
Micro-ID			Organon Teknika, США
API Rapid 20E			BioMerieux, Франция
ЭНТЕРО-тест 1 и 2		18-24	Lachema, Чехия
Энтеро-бактерии и НГОБ^a	API 20E		24-48	BioMerieux, Франция
GN-IDENT		4-13	BioMerieux, Франция
Crystal E/NF		18-20	Becton Dickinson, США
НГОБ	НЕФЕРМ-тест			Lachema, Чехия
API NFT		24-48	BioMerieux, Франция
RapID NF Plus			IDS, США
Грам-отрицательные бактерии	Crystal Rapid Stool/Enteric		18-20	Becton Dickinson, США
Oxi/Ferm		24-48	Becton Dickinson, США
NEG ID Type 2		15-42	Baxter Diagnostics, США
Rapid NEG ID 2			Baxter Diagnostics, США
Анаэробы	АНАЭРО-тест			Lachema, Чехия
AN-IDENT		4^b	BioMerieux, Франция
API 20A			BioMerieux, Франция
RapID ANA II		4-6^b	IDS^c, США
Rapid Anaerobe		4^b	Baxter Diagnostics, США
Стрептококки и энтерококки	СТРЕПТО-тест			Lachema, Чехия
API 20 Strep		4-24	BioMerieux, Франция
Стафилококки и микрококки	ПБДС			НПО «Диагностические системы», Н.Новгород
СТАФИ-тест			Lachema, Чехия
API Staph-IDENT			BioMerieux, Франция
API Staph			BioMerieux, Франция
Нейссерии и моракселлы	НЕЙССЕРИЯ-тест			Lachema, Чехия
Neisseria Enzyme Test		0,5	Carr-Scarborough, США
QuadFERM +			BioMerieux, Франция
Нейссерии и гемофилы	NH-IDENT			BioMerieux, Франция
RapID NH		4 (1)^d	IDS, США
Грам-положительные кокки и листерии	Pos ID		18-48	Baxter Diagnostics, США
Корине-бактерии	API Coryne			BioMerieux, Франция
Грибы	API 20C			BioMerieux, Франция
Примечания: ^a НГОБ – неферментирующие грамотрицательные бактерии. ^b Инкубация в аэробных условиях ^c Innovative Diagnostic Systems ^d Для гонококков

Учет результатов осуществляют либо визуально, либо при помощи специальных считывающих устройств – «ридеров». Их использование позволяет избежать субъективизма при оценке реакции и в конечном счете повышает достоверность идентификации. В некоторых случаях (реакция Фогеса-Проскауэра, тесты на нитратредуктазу, фосфатазу, индол и др.) перед учетом результата теста в лунку необходимо добавить специальные проявляющие реактивы. При этом необходимо использовать только реактивы, входящие в состав диагностического набора.

После учета всех тестов производится кодирование результатов. В простейшем случае каждый положительный признак обозначают знаком «+», а отрицательный – знаком «-». Такое кодирование без использования компьютера делает заключительный этап идентификации весьма продолжительным и трудоемким. В современных системах идентификации для определения «профиля» (кода) культуры используемые тесты разбивают на триады (таблица 30). Положительный результат каждого из тестов, входящих в триаду оценивается как 2ⁿ, где n = 2, 1 или 0, т.е. положительный результат первого теста в триаде кодируется цифрой «4» (2²), второго – цифрой «2» (2¹) и третьего – цифрой «1» (2⁰). Отрицательный результат теста всегда обозначается «0». При сложении результатов тестов в триаде получаем значение от «0» (все тесты в триаде отрицательны) до «7» (все тесты в триаде положительны). Каждая триада дает одну цифру «профиля». Полученный «профиль» может быть использован либо для последующей компьютерной обработки, либо для ручной идентификации с помощью кодовой книги.

Таблица 30

Профиль культуры

СТАФИ-тест	GLY	SUC	TRE	MAN	URE	VPT	PHS	NIT	Cat
Результаты теста	+	+	-	-	+	+	+	+	+
Цифровые значения	4	2	0	0	2	1	4	2	1
Профиль	6	3	7
	637 = Staphylococcus epidermidis
Примечание GLY – глицерин, SUC – сахароза, TRE – трегалоза, MAN – маннит, URE – уреаза, VPT – ацетоин, PHS – фосфатаза, NIT – нитраты, Cat – каталаза.

Как правило, фирмы выпускающие системы для биохимической идентификации микроорганизмов разрабатывают и специальное программное обеспечение для компьютерной обработки результатов. Основу таких программ составляет база данных содержащая частотную матрицу признаков для идентифицируемых микроорганизмов. «Фирменные» программы могут использоваться только с той тест-системой, для которой они разработаны. В то же время существуют различные программы-оболочки, позволяющие пользователю самостоятельно вносить частотные характеристики признаков.

В настоящее время рядом фирм-производителей широко рекламируются системы ускоренной идентификации. Они позволяют получить ответ после 4-6 часов инкубации. Необходимо отметить, что учет этих тестов в более поздние сроки, как правило, приводит к получению неправильных результатов. Использование рапид-систем, по нашему мнению, оправдано при работе в режиме «чрезвычайной ситуации», когда лаборатория работает в круглосуточном режиме.

Идентификация выделенной чистой культуры микроорганизмов предполагает определение ее видовой принадлежности. Однако в некоторых случаях в практических лабораториях оказывается вполне достаточным определение рода микроорганизмов или их принадлежности к определенной группе. В то же время, иногда исследование не заканчивается идентификацией. Так для решения эпидемиологических вопросов необходимо проведение внутривидового типирования. В настоящее время для этого обычно используют: серотипирование, фаготипирование, хемотипирование. Для доказательства этиологической роли выделенного микроорганизма в отдельных случаях также требуется постановка дополнительных тестов. Например, в случае обнаружения Corynebacterium diphtheriae, необходимо дополнительно определить токсигенность выделенной культуры.

Дата добавления: 2015-09-06