Изучение распространенности генов факторов патогенности бактериальных возбудителей ОКИ с использованием молекулярно- биологических методов

Большая часть бактериальных возбудителей ОКИ успешно культивируется в лабораторных условиях, их выявление и идентификация базируется на микробиологических и серологических методах. В то же время имеется ряд областей, связанных с изучением ОКИ, в которых необходимо и целесообразно использование молекулярно-биологических методов. Одним из таких разделов является выявление энтеробактерий, продуцирующих факторы патогенности (токсины, факторы адгезии и инвазии). Наличие факторов патогенности обусловливает эпидемическую значимость штаммов энтеробактерий и их способность инициировать инфекционный процесс в макроорганизме. При этом совокупность различных факторов патогенности определяет симптомокомплекс и тяжесть заболевания.

Исследовались культуры бактерий различных родов семейства Enterobacteriaceae: Shigella, Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia на наличие генов термолабильного (LT), термостабильного (ST), шигаподобного (VT) токсинов и фактора инвазии (Inv). В 1986-1994 гг. для выявления генов патогенности применялись ДНК зонды (разработка

^; лаборатории). Анализ осуществлялся методом гибридизации колоний. С 1994

{

по настоящее время исследования осуществляются методом ПЦР. Использовали лабораторные (in hause) тест системы и коммерческие

)

диагностикумы производства ФГУН «ЦНИИЭ Роспотребнадзора» и Кировского НИИМ МО. Полученные результаты представлены в таблице 10

Таблица 10.

Распространенность генов факторов патогенности у представителей семейства ЕгйегоЬа^епасеае (1985-2006 гг.).

Энтеробактерии	Исследовано штаммов	Частота выявления генов факторов патогенности (в абс.ч.)
VT1	VT2	LT	ST	Inv
Shigella			-	-	-
Escherichia			-	-	-
Salmonella		-	-	-	-	-
Klebsiella,Enterobacter, Citrobacter, Haffnia

Среди клинических изолятов бактерий родов Shigella, Escherichia, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Haffnia не было выявлено штаммов, продуцирующих термолабильный и термостабильный энтеротоксины. Работоспособность зондов и ПЦР тест-систем в отношении этих маркеров подтверждена положительными результатами с коллекционными штаммами, полученными ранее из ГУ НИИЭМ РАМН им. Н.Ф.Гамалеи.

Из генов токсинов выявлялся только ген шигатоксина первого типа VT1. В 1994 г. он был обнаружен у 10 клинических изолятов энтеробактерий, выделеных от больных граждан Вьетнама с тяжелым течением ОКИ (рис. 6). Выделенные от них штаммы окончательно идентифицировать не удалось. По биохимическим свойствам они занимали промежуточное положение между шигеллами и эшерихиями и поступили на исследование как атипичные Е. coli. Возможно, это была инфекция, обусловленная E.coli 0157:Н7. Но на тот

123456789 10 Рис. 6. ПЦР-исследование штаммов E.coli с использованием праймеров к гену шигаподобного токсина VT1

1,10- гидролизат ДНК фага А, эндонуклеазой Hind III

2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 - фрагменты гена шигоподобного токсина VT1.

В 2003 г. ген VT1 был выявлен у 34-х штаммов энтеробактерий: у 11 штаммов Escherichia серовариантов 016, 0144, 075, 026, 0128, 0124 и 23 штаммов Shigella, главным образом у Shigella flexneri 2а.

Наиболее часто выявлялся фактор инвазивности. Он обнаружен у всех клинических изолятов шигелл (536 штаммов) и у 6 штаммов E.coli сероварианта 0124. Шесть штаммов шигелл, у которых оперон инвазивности отсутствовал, хранились в музее культур более 2-х лет. Это свидетельствовало о возможности утраты плазмиды, в составе которой находится оперон инвазивности у представителей рода Shigella, что и было подтверждено при изучении плазмидных профилей этих культур.

момент мы не располагали полным набором тестов для идентификации этого варианта эшерихий как серологическими, так и генетическими методами.

Особо следует отметить эпизод исследования энтеробактерий на наличие генов факторов патогенности с использованием ПЦР тест-системы для детекции вирулентных V.cholerae (НИИ микробиологии МО РФ). В ее состав входили три пары праймеров: первая - специфичная гену холерного токсина, вторая - гену адгезии типичного холерного вибриона, третья - гену адгезии вибриона Эль-Тор. Из данных литературы известно о возможности
обмена генетическим материалом между бактериями семейств Vibrionaceae и Enterobacteriaceae. В частности показано, что ген холерного токсина имеет 70% гомологию с геном LT-токсина и механизмы действия этих токсинов идентичны [83]. В связи с этим представляло интерес провести поиск генетических детерминант вирулентности V.cholerae у энтеробактерий. Было проанализировано 35 штаммов энтеропатогенных эшерихий разных серовариантов, 18 штаммов S.sonnei и 12 штаммов S.flexneri.

Штаммов, имеющих последовательности ДНК, гомологичные гену холерного токсина, выявлено не было. С праймерами к генам адгезии также не взаимодействовало большинство исследованных культур. Исключение составили 3 штамма Е. coli сероварианта 0127, процессе амплификации их генома с праймерами к гену адгезии типичного холерного вибриона синтезировался фрагмент ДНК размером около 300 п.о. Результат не мог быть артефактом, так как амплификация проводилась в жестких условиях ирезультат подтверждался в нескольких повторах. Полученные данные свидетельствуют о наличии у E.coli 0127 генетических структур сходных по нуклеотидной последовательности с геном адгезии холерного вибриона. Данный факт установлен впервые.

Полученные в ходе многолетних исследований результаты свидетельствуют о том, что для Нижегородского региона не характерна циркуляция токсигенных штаммов энтеробактерий. На двух этапах исследования выявлялись только гены токсина VT1. Причем токсигенные E.coli, выявленные в 1994г., являлись завозными штаммами. Последующие находки штаммов шигелл и эшерихий с геном токсина VT1 относятся к 2003 г. Ген VT1 чаще встречался в клинических изолятах S.flexneri 2а. Этот факт согласуется с литературными данными о том, что S.flexneri 2а, доминировавший в то время в этиологической структуре дизентерии в РФ, в ряде случаев вызывал глубокие поражения кишечника, что в ряде случаев приводило к летальному исходу заболевания [91].

В последующие годы - 2004, 2005, 2006 гг. находок токсигенных штаммов не было. Возможно, это связано со сменой доминирующего штамма шигелл (в настоящее время преобладает S. sonnei) и с тем, что токсигенные штаммы достаточно быстро элиминируются из бактериальных популяций. Нельзя исключить, что токсигенные изоляты в 2003г. являлись преимущественно завозными штаммами, поскольку активность миграции населения значительно возросла.

В заключение этого подраздела особо следует отметить выявление у штаммов Е.соН 0127 генетических детерминант, имеющих гомологию с геном адгезии V.cholerae tcpA, что обнаружено нами впервые.

Проведенные исследования показали, что гены факторов патогенности характерны для бактерий родов Shigella и Escherichia. У бактерий рода Salmonella и других представителей семейства Enterobacteriaceae генов факторов патогенности не выявлено, несмотря на имеющиеся в литературе данные об обмене генетическим материалом среди различных родов и видов энтеробактерий.

Наиболее практически значимым из результатов данного исследования явилось подтверждение факта, что все свежевыделенные культуры шигелл содержат гены оперона инвазивности. В дальнейшем это послужило базой для разработки ПЦР тест системы для выявления бактерий рода Shigella и энтероинвазивных эшерихий.

В настоящее время, несмотря на значительный прогресс, нет основания считать проблему выявления энтеробактерий, содержащих факторы патогенности, полностью методически решенной. Все ПЦР тест системы для детекции генов факторов патогенности стабильно работают на чистых культурах возбудителей ОКИ. Исключение составляет диагностику для выявления оперона инвазивности, который позволяет выявлять шигеллы и инвазивные эшерихии в клиническом материале и объектах внешней среды.

Разработка тест-систем для выявления генов энтеротоксинов в различных субстратах имеет как теоретическое, так и практическое значение.

Применение таких диагностикумов позволит широко проводить изучение циркуляции генов патогенности, поскольку не потребуется выделения чистой культуры бактерий, и расширит возможности диагностики атипичных ОКИ с тяжелым клиническим течением, даст возможность осуществлять объективный контроль пищевых продуктов (в первую очередь, импортированных из стран Южной и Юго-восточной Азии). Наиболее целесообразна разрабортка мультиплексной тест-системы для выявления генов токсинов LT, ST, VT1, VT2 и фактора инвазивности одновременно в одной ПЦР реакции. Такой вариант анализа экономичен, прост, производителен. Имеющиеся в настоящее время методические возможности позволяют успешно решить эту задачу.

Дата добавления: 2015-07-20