Выбор приборов для проведения ПЦР и фиксирования результатов.

Для проведении ПЦР-детекции использовались три модели отечественных ДНК-амплификаторов: 1-Института биофизики РАН, г. Пущино-на-Оке; 2-«Ампли-250» фирмы «Вюкот» г. Москва; «Терцик МС2» фирмы «ДНК-технология» г. Москва.

На наш взгляд наименее удачным был прибор института биофизики РАН. Его термоэлемент, вместимостью 24 пробирки на 0,5 мл или 12 пробирок на 1,5 мл, не поддерживал установленный температурный режим нагрева пробирок с реакционными смесями, что снижало эффективность амплификации. На этом амплификаторе удалось проверить работоспособность диагностикумов с помощью положительных и отрицательных контролей, входящих в его комплект.

Приборы «Ампли-250» и «Терцик МС2» могут быть рекомендованы для исследования клинического материала. По сравнению с прибором фирмы «Вюкот» «Терцик МС2» имеет ряд преимуществ: у него большая вместимость нагревательного элемента (40 пробирок вместо 36); нагревательный элемент представлен четырьмя независимо программируемыми блоками емкостью по 10 пробирок, что позволяет одновременно проводить амплификации при четырех разных режимах; наряду с автономным режимом работы имеется возможность подключения к компьютеру, что позволяет отслеживать процесс в графическом и в цифровом режимах; имеется возможность проведения ПЦР в условиях активного регулирования процесса, что уменьшает продолжительность исследования.

В нашей работе подавляющая часть экспериментов проведена с использованием амплификаторов «Терцик МС2». С середины 90-х годов по настоящее время этот прибор является базовым для большинства ПЦР- лабораторий Российской Федерации.

Для выявления продуктов амплификации использован метод электрофореза в агарозном геле. Изображения электрофореграмм фиксировали отечественной компьютерной системой «Биотест» (фирмы «Биоком», Москва). Такой вариант проще и информативней традиционной фотосъемки. Стоимость системы «Биотест» в 3 раза меньше зарубежных аналогов (систем «Bio-Rad», США и др.).

2.2.1.2. Сравнение вариантов выделения нуклеиновых кислот из клинического материала.

Одной из задач данного исследования являлся выбор варианта обработки проб биологического материала: слюны, мочи, крови, биоптатов, желудочного сока, фекалий и др. Простой и быстрый вариант обработки кипячением, описанный Roosendaal R. с соавторами [315] результатов не дал. Во всех пробах, подвергнутых нагреванию, амплификация ДНК не происходила. Очевидно, имело место ингибирование Taq-полимеразы не удаленными макромолекулами (белками, липидами, полисахаридами).

Экспресс-метод обработки клинического материала, предложенный фирмой «Литех» (г. Москва),, также оказался непригодным для подготовки проб крови, слюны, биоптатов к проведению ПЦР.

В дальнейшем использовались более сложные способы, позволяющие получить очищенный раствор нуклеиновых кислот из любого типа клинического материала. Традиционный метод выделения ДНК, состоящий из этапов разрушения клеток ферментами (протеиназой К, проназой), фенольно-хлороформной депротеинизации ДНК с последующим осаждением ее спиртами [47], позволил получить материал, пригодный для проведения ПЦР. Вместе с тем, этот метод имел недостатки, мешающие рекомендовать его для практического применения. Он сложен, состоит из большого количества этапов, продолжительность около 5 часов; требуется применение дорогостоящих ферментных препаратов с ограниченным сроком годности и высокотоксичных веществ (фенол, хлороформ).

Среди способов подготовки проб оптимальными оказались варианты, состоящие из стадий лизиса клеток детергентом (гуанидинизотиоцианатом), сорбции ДНК на носителе (макропористое стекло, силикагель), отмывки сорбированной ДНК от других макромолекул и элюирования ДНК с носителя ТЕ-буфером. Апробированы комплекты реактивов для сорбционного выделения ДНК фирмы «Литех» - «Набор для выделения ДНК из биопроб» и ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора - «ДНК-сорб А», «ДНК-сорб Б». Сорбционные технологии несколько уступают фенольному методу. Он позволяет получить более чистый препарат ДНК при меньших потерях основного вещества. Однако сорбционные методы более технологичны, менее затратны, не требуют использования токсичных веществ, выделение ДНК занимает в 2-2,5 раза меньше времени. Получаемый препарат нуклеиновых кислот пригоден для проведения ПЦР. В дальнейшем для практических исследований нами использовались наборы для подготовки проб производства ЦНИИЭ, которые обладали лучшими рабочими характеристиками.

Дата добавления: 2015-07-20