Адаптация ПЦР тест-системы для выявления генов токсина и адгезинов V.holerae.

При проведении работ в соответствии с наставлением по применению тест-системы, представленным разработчиком (НИИ микробиологии МО, г. Киров) не удалось получить интерпретируемые результаты, в связи с низкой

эффективностью ПЦР и наличия неспецифического синтеза в положительных контролях и исследуемых образцах. В ходе адаптации тест системы были внесены следующие изменения: для проведения ПЦР использован принцип верхней и нижней реакционных смесей, в качестве нижней смеси использовались праймеры и дезоксинуклеотидтрифосфаты из комплекта данной тест-системы, в качестве верхней была использована универсальная верхняя реакционная ПЦР-смесь производства ФГУН «ЦНИИЭ Роспотребнадзора»; программа амплификации, основанная на регулировании процесса по температуре матрицы, заменена на программу с активным регулированием, температура на стадии отжига праймеров увеличена на 2° С (см раздел 2.1. Материалы и методы). 2.2.1.7. Адаптация ПЦР тест-систем для выявления H.pylori.

Нами были апробированы три отечественные тест-системы: «Helicobacter» (СП «Ниармедик», Москва), «АмплиСенс-Helicobacter pylori- 520» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) и «Хеликопол II» (фирмы «Литех», Москва). Специфичность этих систем показана разработчиками и рядом авторов [16, 47]. По их данным, праймеры гибридизовались с геномом H.pylori и не взаимодействовали с ДНК близкородственных видов (C.jejuni, С. fetus, С. venereae) и рядом других микроорганизмов (V.cholerae, F.tularensis, Y.pestis, Y. pseudotuberculosis, Y.enterocolitica, E.coli, L.pneumofila, L.interrogans), а также с ДНК человека и теленка [47]. Проведенные нами исследования с препаратами хромосомной ДНК бактерий родов семейства Enterobacteriaceae (Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter) также подтвердили специфичность тест- систем.

Первой на отечественном рынке появилась тест-система «Helicobacter» производства СП «Ниармедик» (Москва), выявляющая фрагмент гена 16SpPHK H.pylori размером 209 п.н.

При исследовании биоптатов слизистой желудка тест-системой «Helicobacter» по инструкции разработчиков, кроме амплификации специфического фрагмента синтезировались фрагменты ДНК размером - 500 п.н. и 2000 п.н. (рис. 2, 3). Они присутствовали как в Н. pylori положительных, так и отрицательных образцах.

2000 п.н 500 п.н. 209 п.н.

12 34 56 78 К+

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации биоптатов слизистой желудка. ПЦР проведена в соответствии с инструкцией разработчиков

123456 78 К+ Рис. 3. Электрофореграмма продуктов амплификации биоптатов слизистой желудка. ПЦР проведена при уменьшении количества праймеров,

трифосфатов и фермента до 90% от рекомендуемых разработчиками норм и сокращении стадии элонгации цепи с 5 до 3 мин.

Неспецифические фрагменты ухудшали качество электрофореграмм и зарудняли интерпретацию резултата. Было предположено, что фрагменты в 500 п.н. и 2000 п.н. образуются при амплификации участков геномной ДНК. Освободиться от балластных нуклеиновых кислот без потери специфической ДНК-мишени невозможно. Для снижения эффективности неспецифического синтеза была проведена серия экспериментов:

• амплификация в обедненной реакционной смеси (уменьшение количества праймеров, нуклеотидтрифосфатов, Тац-полимеразы);

• амплификация с менее продолжительной стадией синтеза цепи;

• амплификация при увеличении температуры отжига праймеров.

Количество праймеров, трифосфатов и фермента было сокращено до 80% от нормы, температура отжига праймеров увеличена с 66°С до 67°С и продолжительность стадии синтеза уменьшена с 4 до 2,5 мин. При данном режиме были получены наиболее качественные результаты.

Оптимизация состава реакционной смеси и программы амплификации позволила значительно снизить уровень неспецифического синтеза, не уменьшая объема амплификации специфического фрагмента. Сохранение синтеза неспецифических фрагментов при оптимизированной ПЦР свидетельствовало о не достаточно качественном дизайне праймеров тест- системы.

При использовании тест-системы фирмы «Ниармедик» для исследования проб желудочного сока неспецифический синтез ДНК, как правило, не наблюдался. Это объясняется низким содержанием эукариотической ДНК в желудочном соке по сравнению с биоптатом.

Апробация ПЦР тест-систем второго поколения. Были апробированы тест-система «Хеликопол II» производства фирмы «Литех», Москва, амплифицирующая участок гена уреазы (игеС) Н.ру1оп размером 492 п.н. и
тест-система «АмплиСенс-Helicobacter pylori-520» производства ФГУН «ЦНИИЭ Роспотребнадзора», амплифицирующая фрагмент гена 16SpPHK размером 520 п.н. Эти тест-системы были совершеннее, чем «Helicobacter». Они обладали достаточно близкими рабочими характеристиками: были удобны в работе и имели удачно подобранные праймеры. При сравнительном исследовании тест-система «АмплиСенс-Helicobacter pylori-520» показала более высокую чувствительность (рис. 4).

При работе с этими тест-системами не было необходимости варьировать состав реакционной смеси. Мы изменили лишь программу амплификации - температура отжига праймеров была увеличена на 2°С. Поскольку такое изменение положительно сказалось на работе обеих тест систем, можно предположить, что это связано с индивидуальными особенностями амплификатора, использованного в работе.

ПЦР тест система «АмплиСенс-Н.ру1оп-520»

ПЦР тест-система «Хеликопол II»

исх. 10"^[3] 10"² 10"³ КГ⁴ 10"⁵ 10"⁶ 10"⁷ К+ проба

Рис. 4. Сравнение чувствительности ПЦР тест-систем «АмплиСенс-H.pylori- 520» и «Хеликопол II» при выявлении Н. pylori в десятикратных разведениях ДНК, выделенной из пробы желудочного сока.

• 7

ДНК Н. pylori выявлялась в разведении 10" при использовании тест- системы «АмплиСенс-Н.ру1оп-520». Последнее разведение ДНК, в котором
присутствовал специфический фрагмент при работе с тест-системой «Хеликопол II» - 10"⁶. В дальнейших исследованиях использовалась ПЦР тест-система «АмплиСенс-НеПсоЬас1ег ру1оп-520» ФГУН «ЦНИИЭ Роспотребнадзора», так как она имела большую чувствительность и была удобнее в работе.

Контроль ингибирования ПЦР. Все отечественные ПЦР тест-системы для выявления Н.ру1оп не содержат компонентов, позволяющих контролировать возможность ингибирования ПЦР. Для решения этой задачи используется внутренний контрольный образец (ВКО) - фрагмент ДНК, содержащий на концах участки гомологичные праймерам тест-системы. ВКО вводится в пробу на стадии подготовки и проходит все этапы выделения ДНК. При положительном исходе ПЦР синтезируются два фрагмента: специфический фрагмент ДНК-мишени и фрагмент, синтезирующийся с ВКО. Размер ВКО должен отличаться от размера специфического фрагмента. Как правило, он больше специфического, и в процессе электрофореза образуются две полосы, верхняя соответствует ВКО, нижняя - ДНК мишени (рис. 5).

Количество ВКО, вносимое в пробу, рассчитывается таким образом, чтобы он минимально конкурировал со специфической мишенью за компоненты реакционной смеси и не снижал чувствительность тест-системы.

При высокой концетрации ДНК-мишени возможен синтез только специфического фрагмента, при этом на электрофореграмме наблюдается одна яркая полоса, (рис 12 трек К+). При отрицательном результате синтезируется только фрагмент ВКО. Отсутствие полос на электрофореграмме свидетельствует об ингибировании ПЦР. В этом случае требуется повторная обработка пробы.

Специфический ВКО в тест-системе «АмплиСенс-Helicobacter pylori- 520» отсутствует, поэтому в его качестве был использован универсальный внутренний контрольный образец (УВКО) тест-систем для детекции возбудителей урогенитальных инфекций ФГУН «ЦНИИЭ Роспотребнадзора». Пробы, в которых H.pylori не был выявлен, амплифицировали с праймерами для U.urealyticum. Отсутствие фрагмента УВКО U.urealyticum размером 750 п.н. свидетельствовало об ингибировании реакции иложноотрицательном результате при выявлении H.pylori.

Этим методом была оценена вероятность ложноотрицательных результатов ПЦР-детекции H.pylori. Из 46 образцов биоптатов слизистой желудка, обработанных с помощью «ДНК-сорб А», ингибирование ПЦР наблюдалось в 4 случаях. При использовании для подготовки тех же проб «ДНК-сорб Б», в котором предусмотрена дополнительная отмывка буфером, содержащим гуанидинизотиоцианат, ингибирование ПЦР не отмечалось.

В дальнейших исследованиях подготовку проб биоптатов и желудочного сока проводили только «ДНК-сорб Б». УВКО добавляли в каждую пробу, чтобы в спорной ситуации имелась возможность выявлять и

2.2.1.8. Разработка полуколичественного варианта ПИР детекции Н.ру1оп для контроля эффективности антихеликобактерной терапии.

Большинство существующих методов диагностики не позволяют осуществлять ранний контроль эффективности антихеликобактерной терапии. Для решения этой задачи нами разработан полу количественный вариант ПЦР, позволяющий оценивать изменения уровня обсемененности слизистых Н.ру1оп до и после лечения. Ранее проведенные исследования показали, что наиболее интегративным и информативным субстратом для ПЦР-детекции Н.ру1оп является утренняя тощаковая порция желудочного сока. Метод базируется на ПЦР обнаружении хеликобактера в десятикратных разведениях ДНК, выделенной из проб желудочного сока до и после лечения. Н.ру1оп выявляется в разведениях в 10, 100. 1000 раз. Применение метода на практике описано в главе ПЦР в диагностике хеликобактерной инфекции и изучении ее возбудителя.

2.2.1.9. Адаптация ПЦР тест-системы для выявления гена вакуолизирующего цитотоксина Н.ру1оп УасА.

Затруднения возникли при выявлении гена УасА Н.ру1оп с использование тест-системы «Хеликопол УА» фирмы Литех г. Москва. Она имела сложную комплектацию - содержала три пары праймеров для выявления аллельных б и гп вариантов. Первая пара при проведении ПЦР дискриминирует варианты и б2 (синтезируется один из двух фрагментов, различающихся по размеру - 259 п.н. для и 286 п.н. для б2). Вторая и третья пары выявляют в отдельных ПЦР реакциях т1 и т2 аллели, при этом синтезируются фрагменты размером 352 п.н. и 290 п.н. соответственно. Таким образом, для определения УасА-генотипа необходимо проведение трех отдельных ПЦР.

При апробации трех комплектов праймеров на положительном контроле и клинических пробах в соответствии с инструкции по применению наблюдался синтез большого количества различных по размеру фрагментов ДНК, среди которых невозможно было выделить специфические варианты.

Кроме того, ряд проб при наличии реакции с праймерами на ш-участок УасА-гена не взаимодействовали с праймерами к участку э; имелись и обратные варианты, с наличием синтеза с праймерами к аллелям э, и не дающие синтеза с праймерами к аллелям т.

С целью снижения эффективности неспецифического синтеза была проведена оптимизация условий проведения ПЦР. Повышение температуры на стадии отжига на 2°С (для праймеров на аллели ш1, б2), на 3°С (для праймеров на аллель т2) и снижение количества праймеров, дезоксинуклеотидтрифосфатов и Тац-полимеразы до 80% от нормы позволило существенно уменьшить количество неспецифических фрагментов. Для тест-системы на аллель ш1 была получена однозначная картина - в контроле и положительных пробах синтезировался только специфический фрагмент. С праймеров на аллели и з2 во всех пробах продолжали синтезироваться фрагменты размером ориентировочно 500п.н. и 700 п.н., которые не мешали интерпретации результата. С праймеров на аллель ш2 при амплификации во всех исследуемых образцах синтезировались 2-3 крупных фрагмента с размерами в интервале 800-1000 п.н. Наличие крупных неспецифических фрагментов не мешало дискриминации на электрофореграммах специфических фрагментов. Следует отметить, что неспецифические фрагменты, сохранившиеся после повышения температуры отжига праймеров, синтезировались более эффективно, чем специфические. При дальнейшем подъеме температуры отжига они продолжали синтезироваться, в то время как образование специфических фрагментов практически прекращалось. Таким образом, проведенная оптимизация условий ПЦР позволила добиться интерпретируемых результатов. Сохранение эффективного

неспецифического синтеза свидетельствовало о недостатках дизайна праймеров. В дальнейшем все исследования на аллельные варианты гена УасА проводились по модернизированным программам.

Дата добавления: 2015-07-20