Читайте также:
|
ПЦР детекция возбудителей вирусных гепатитов и НУГИ являются наиболее коммерчески выгодными и востребованными направлениями. Разработке ПЦР тест-систем на данные инфекционные агенты уделялось существенное внимание, поэтому среди отечественных диагностикумов эти тест-системы наиболее качественные и представлены большим количеством вариантов. По техническим характеристикам, простоте и удобству проведения исследования предпочтительнее других были тест-системы производства ФГУН «ЦНИИЭ Роспотребнадзора» и фирмы «Изоген» (Москва). Системы серии «Ампли-сенс» ФГУН «ЦНИИЭ Роспотребнадзора», представляют собой комплекс из двух реакционных смесей: нижней, состоящей из праймеров и нуклеотидтрифосфатов и верхней, состоящей из компонентов буфера для проведения ПЦР, Tag- полимеразы, красителя для электрофореза. Нижняя смесь внесена в пробирки 0,5 мл или 0,2 мл и запечатана пробкой из легкоплавкого воска. Для проведения исследования в пробирки добавляется ПЦР-смесь-2, сверху наслаивается минеральное масло, под которое вносится исследуемый образец, после чего проба готова к ПЦР. В тест-системах «Изоген» большая часть компонентов реакционной смеси лифилизирована в микропробирке. Подготовка к проведению ПЦР заключается в растворении осадка элюентом, входящим в состав диагностикума, наслаивании минерального масла и внесении под него пробы. Эти варианты подготовки минимизирует манипуляции с компонентами реакционной смеси, что уменьшает вероятность контаминации и позволяет избежать ложноположительных результатов. Достоинством тест-систем «АмплиСенс» и «Изоген» является также то, что для выявления M.hominis, U.urealyticum, C.trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II используются единые универсальные программы амплификации. Кроме этого у систем «АмплиСенс» исключается возможность низкотемпературного неспецифического синтеза, поскольку реакция полимеризации ДНК начинается только после плавления восковой перегородки при 95° С.
Для проведения исследований возбудителей вирусных гепатитов и НУГИ нами были выбраны тест-системы «АмплиСенс». Это сделано по двум причинам: у них температура отжига праймеров выше, чем у систем «Изоген», что способствует более высокой специфичности исследования; продолжительность программы амплификации у диагностикумов «АмплиСенс» практически в 2 раза меньше, это сокращает продолжительность исследования и способствует более длительной эксплуатации амплификаторов. Адаптация к практическим исследованиям систем «АмплиСенс» особых проблем не вызвала. При работе на определенных амплификаторах была на 1 -2° С увеличена температура отжига праймеров.
2.2.1.11. Разработка полуколичественного варианта ПЦР для детекции ВГВ и ВГС. Этот вариант был разработан для оценки вирусной нагрузки и эффективности противовирусной терапии. Основными критериями для метода являлись максимально низкая себестоимость, простота исполнения и максимально возможная информативность и достоверность. Предложенная схема базируется на использовании классического варианта ПЦР с элекрофоретической детекцией продукта амплификации.
Для оценки концентрации вируса был использован метод десятикратных серийных разведений. Нами были изучены три варианта:
-при первом варианте разводили плазму или сыворотку из каждого разведения выделяли нуклеиновые кислоты, для каждого проводили обратную транскрипцию и ПЦР;
-при втором варианте из сыворотки или плазмы выделяли нуклеиновые кислоты, делали их десятикратные разведения, для каждого из них проводили обратную транскрипцию и ПЦР;
-при третьем варианте из сыворотки или плазмы выделяли нуклеиновые кислоты, осуществляли одну реакцию обратной транскрипции, делали
десятикратные серийные разведения полученной к-ДНК и для каждого из них проводили ПЦР.
Анализировали разведения в 10, 100, и 1000 раз. Результаты, полученные при использовании любого из трех вариантов, оказались идентичными. Для определения вирусной нагрузки был выбран вариант 3 как самый экономичный и непродолжительный. В этом варианте проводится однократное выделение нуклеиновых кислот и одна обратная транскрипция, а на последней стадии осуществляется несколько ПЦР, соответствующих количеству разведений.
Экспериментально было установлено, что минимально достаточно проанализировать для ДНК-содержащих вирусов (ВГВ, ТТУ) разведения в 10, 100 и 1000 раз; для РЖ - содержащих (ВГА, ВГС, ВГО, ВГО) - разведения в 10 и 100 раз.
| Расчет вирусной нагрузки ВГВ в соответствии с результатом ПЦР- исследования десятикратных серийных разведений. |
При оценке концентрации вируса использовали следующий подход. В информационных материалах на ПЦР тест-системы (паспорта, рекламные буклеты) указано, что в тестах на ДНК- содержащие объекты достигается чувствительность около 100 частиц/мл, а в тестах на РНК-содержащие объекты — 1000 частиц/мл. В соответствии с этими показателями чувствительности используемых тест-систем проводили расчет относительной концентрации вируса (таблицы 8, 9).
Таблица 8.
|
| * + положительный результат в ПЦР; - отрицательный результат в ПЦР |
Таблица 9.
|
| * + положительный результат в ПЦР; - отрицательный результат в ПЦР |
Приведенный выше вариант ПЦР, названный нами полуколичественным, оказался достаточно объективным и информативным для определения вирусной нагрузки и оценки эффективности противовирусной терапии. Он значительно дешевле исследований с применением тест-систем, использующих гибридизационно-ферментное выявление продукта, и ПЦР, базирующейся на технологии «Real time».
| Расчет вирусной нагрузки ВГС в соответствии с результатом ПЦР- исследования десятикратных серийных разведений. |
На данном этапе работы были выбраны оптимальные: модели отечественного ДНК-амплификатора и гельдокументирующей установки, методы выделения ДНК из клинического материала. Разработан ряд авторских ПЦР тест-систем. Проанализированы, отобраны, апробированы и адаптированы к практической диагностике коммерческие и экспериментальные отечественные ПЦР тест-системы для выявления и изучения возбудителей ОКИ, хеликобактериоза, гепатитов, НУГИ. Оптимизированы их реакционные смеси и программы проведения амплификации. Проведенная подготовка позволила максимально упростить, удешевить процедуру ПЦР-исследования, сократить время ее проведения и по возможности избежать или контролировать появление ложноположительных и ложноотрицательных результатов.
2.2.2. Значимые направления использования молекулярно-биологических методов в диагностике бактериальных ОКИ
На данном этапе работы проводилось определение роли и места ПЦР в комплексе методов диагностики бактериальных ОКИ, разработка оптимальных алгоритмов применения ПЦР в клинической практике и в системе эпиднадзора за ОКИ.
Дата добавления: 2015-07-20; просмотров: 216 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая страница | | | следующая страница ==> |
| Адаптация ПЦР тест-системы для выявления генов токсина и адгезинов V.holerae. | | | Изучение распространенности генов факторов патогенности бактериальных возбудителей ОКИ с использованием молекулярно- биологических методов |