Сложности, возникающие при использовании ПНР в практической диагностике.

Следует отметить, что наряду с неоспоримыми преимуществами перед другими методами детекции микроорганизмов, ПЦР и другие технологии, использующие принцип амплификации нуклеиновых кислот, имеют ряд недостатков, осложняющих их внедрение в практическую диагностику.

Создание ПЦР-лаборатории влечет за собой приобретение большого количества дорогостоящего оборудования, которого, как правило, не имеется в типовой бактериологической лаборатории.

Согласно «Методическим рекомендациям по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции» ПЦР-лаборатория размещается минимум в двух, а лучше в трех изолированных помещениях (по одному для каждой стадии метода) [66].

При использовании матричного синтеза ДНК и РНК имеется вероятность ложноположительных результатов за счет контаминации исследуемых проб и реактивов ампликонами или исходной ДНК-матрицей. Возможны два варианта контаминации:

- тотальная контаминация вызывается загрязнением реактивов для обработки проб и проведения ПЦР ампликонами, микроорганизмами или их ДНК. При такой контаминации получаются только положительные результаты. Правильная планировка лаборатории, соблюдение требований упомянутых выше Методических рекомендаций существенно снижает вероятность тотальной контаминации. Если она произошла, необходимо заменить все реактивы и провести тщательную обработку рабочих помещений. В лабораториях с высоким уровнем подготовки специалистов случаи тотальной контаминации редки. Достижения последних лет (антиконтаминационная модификация ампликонов, технологиий ПЦР в реальном времени и «End point») сводят до минимума вероятность тотальной контаминации.

-спорадическая контаминагщя обусловлена попаданием микроорганизмов, их нуклеиновых кислот, продуктов амплификации в отрицательные пробы. От данной контаминации не застрахована ни одна лаборатория, поскольку сложно установить сам ее факт. Одним из ее признаков является значительное, нелогичное увеличение количества положительных результатов. Небрежность при отборе проб, транспортировке материала, выделении нуклеиновых кислот, постановке ПЦР может привести к спорадической контаминации. Для ее профилактики необходимо повышать квалификацию сотрудников ПЦР-лабораторий.

Таким образом, современные амплификационные и гибридизационные технологии за счет повышения чувствительности, специфичности, объективности и технологичности исследований позволяют поднять на новый уровень диагностику инфекционных заболеваний. При этом следует учитывать, что успех ДНК-РНК диагностики зависит от интеграции новейших достижений с традиционными методами исследования. В связи с этим, наиболее перспективны многопрофильные научно-методические комплексы, способные на высоком уровне выполнять клинико- биохимические, микробиологические, иммунологические и молекулярно- генетические исследования.

1.2. Современная лабораторная диагностика ряда актуальных бактериальных и вирусных инфекций 1.2.1 Диагностика бактериальных ОКИ.

Большая часть бактериальных возбудителей ОКИ - бактерии родов Shigella, Salmonella, Escherichia, Yersiniae являются классическими объектами медицинской микробиологии. Они хорошо культивируются в лабораторных условиях.

Бактериологический метод в связи с этим является базовым для детекции и идентификация бактериальных возбудителей ОКИ. Определение родовой и видовой принадлежности изолятов проводится по биохимическим тестам, для подтверждения идентификации используется серотипирование с родоспецифичными и видоспецифичными антисыворотками. Эпидмаркирование штаммов осуществляется за счет дополнительных биохимических тестов, фаготипирования, бактериоцинотипирования. Имеются официальные методические указания, регламентирующие микробиологическую диагностику заболеваний, вызванных энтеробактериями.

Единственными труднокультивируемыми микроорганизмами среди бактериальных возбудителей ОКИ являются представители рода Campylobacter. Для их культивируются в лабораторных условиях требуются сложные, дорогостоящие питательные среды и анаэростаты. В разделе 1.2.2 «Диагностика хеликобактерной инфекции» подробно изложены условия культивирования микроаэрофилла H.pylori - микроорганизма, близкородственного кампилобактерам.

Бактериологический метод является основным и доминирующим при выявлении бактериальных возбудителей ОКИ. Вместе с тем имеются характеристики, ограничивающие его возможности. Одним из недостатков бактериологического анализа является продолжительность, составляющая 5­7 дней. Поэтому разработка методов быстрого выявления энтеробактерий, является актуальной. Системы для экспресс-индикации этих возбудителей, основанные на иммунологических методах, не нашли применения в практике из-за неспецифических перекрестных реакций, обусловленных наличием общих и сходных антигенов у различных представителей семейства Enterobacteriaceae.

Молекулярно-биологические методы диагностики бактериальных возбудителей ОКИ.

Экспрессное выявление бактериальных возбудителей ОКИ стало возможным благодаря использованию молекулярно-биологических методов, главным образом, ПЦР. С их помощью в значительной мере удалось разрешить проблему обнаружения факторов патогенности у штаммов энтеробактерий, которая не решалась традиционными методами исследования.

Разработка в 80-е годы молекулярных зондов, специфичных в отношении кластера генов ipa А, В, С, D, Н оперона инвазивности послужила отправной точкой для подбора участка-мишени и праймеров для индикации шигелл и энтероинвазивных E.coli методом ПЦР [232, 335].

Первые публикации о применении ПЦР для детекции энтеробактерий появились в конце 80-х годов 20 века. Новые тест-системы позволяли быстро и эффективно выявлять шигеллы по наличию факторов патогенности: генов инвазивности [335, 232] и гена шигатоксина [206, 226]. Впоследствии были разработаны ПЦР тест-системы для выявления гена шигаподобного токсина у энтеротоксигенных эшерихий [207, 279]. Это позволило обнаруживать токсинпродуцирующие E.coli у больных и в объектах окружающей среды [247,313,350].

Много работ посвящено ПЦР детекции Е. coli 0157-Н7, которые вызывают в разных странах вспышки ОКИ с геморрагическим синдромом, и могут быть причиной смерти заболевших [266, 302, 371]. Разработан экспресс вариант ПЦР в реальном времени для мультиплексного анализа на наличие генов шигатоксинов stxl и stx2. Он применяется для тестирования проб фекалий больных ОКИ и позволяет выявить токсигенные эшерихии в тех образцах, которые дали отрицательный результат при культуральном исследовании [116].

Метод ПЦР широко используется в диагностике ОКИ, получившей название «диарея путешественников». Её возбудителем являются E.coli, продуцирующим термолабильный (LT) и термостабильный (ST) токсины. В качестве мишени для амплификации используют фрагменты генов этих токсинов [104, 170].

В начале 90-х годов появляются публикации о применении метода ПЦР для детекции сальмонелл [95, 156, 227]. Way J.S. с соавторами была создана мультиплексная ПЦР тест-система для выявления бактерий рода Salmonella [369]. В ней используются 3 пары праймеров: одна из них специфична к фрагменту гена, общего для сальмонелл, шигелл и эшерихий и служит для детекции энтеробактерий трех родов. Две другие пары специфичны для генов бактерий рода Salmonella. Таким образом, в образце выявляются представители семейства Enterobacteriaceae, и отдельно - сальмонеллы.

В 90-е годы 20 века также были разработаны ПЦР тест системы для выявления бактерий рода Campylobacter и бактерий Yersinia eterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis [152, 300].

В настоящее время при диагностике ОКИ чаще применяют тест - системы мультиплексного формата, позволяющие выявлять несколько инфекционных агентов [97, 331, 363].

Oyofo с соавторами предложна мультиплексная система для одновременного выявления энтеротоксигенных E.coli, бактерий родов Shigella и Campylobacter [294].

В Корее разработан вариант «Real time» ПЦР с использованием интеркалирующего красителя sibre Green для одновременного выявления virA гена Shigella flexneri и invA гена Salmonella typhimurium в фекалиях. Этап выделения ДНК отсутствует. Чувствительность метода составила 40 кл/гр фекалий [364]. Мао Н. с соавторами предложена мультиплексная ПЦР тест-система для выявления гена uidA Е. coli. 0157:Н7, invA гена Salmonella ssp. и ipaH гена Shigella ssp. Разделение продуктов ПЦР осуществляется методом капиллярного электрофореза в акриламидном геле [254].

В Индии с использованием мультиплексных ПЦР тест систем выявлялись диареегенные бактерии в пробах фекалий от больных дошкольников (780 проб). Наиболее часто обнаруживались энтероинвазивные E.coli (8,2%), энтеропатогенные E.coli (3,5%), энтеротоксигенные E.coli (1,3%). Энтерогемораргические E.coli, бактерии Shigella spp, Vibrio cholerae и Salmonella обнаружены в единичных случаях [106].

При исследовании 300 фекальных проб от больных диареей детей в

Мексике методом мультиплексной ПЦР бактерии рода Salmonella выявлены в 53,5% случаев, диареегенные E.coli -в 33,2%, бактерии рода Shigella - в 2,6%. Все исследованные образцы содержали один или несколько видов возбудителей [296].

Осуществлялось сравнение эффективности бактериологического метода и метода ПЦР. В Бангладеш проведено параллельный анализ фекалий больных дизентерией бактериологическим методом и ПЦР. Для проб, из которых выделены шигеллы, получен положительный результат и в ПЦР. Методом ПЦР шигеллы были выявлены в ряде проб, отрицательных в бактериологическом анализе. Чувствительность бактериологического исследования составила 72%, а ПЦР — 100%. Метод ПЦР был предложен авторами для рутинной диагностики кишечных инфекций [205].

В Таиланде проведено сравнение бактериологического метда и ПЦР при контроле эффективности антибиотикотерапии больных шигеллезом. Метод ПЦР был более чувствительным и информативным. Он выявлял шигеллы у больных на фоне антибиотикотерапии при отсутствии диареи [329].

При обследовании 150 детей с острым гастроэнтеритом в Палестине традиционным методом и ПЦР результаты совпали. Бактериальные возбудители ОКИ обнаружены в 17.3 % образцов (Shigella spp - 6,0 %), Campylobacter coli/jejuni - 4.7 %, Escherichia coli 0157:H7 - 4.7 %, Salmonella spp - 2,0 %). Авторы считают целесообразным комбинирование традиционных и молекулярных методов при диагностике бактериального гастроэнтерита [296].

Метод ПЦР активно используется для проверки контаминации продуктов питания, пищевого сырья, воды энтеробактериями. Wang R.F. с соавторами разработана ПЦР тест-система, позволяющая проводить экспресс-детекцию 13 патогенных микроорганизмов (в основном возбудителей ОКИ) в продуктах питания [364].

Мультиплексная тест-система была использована для детекции сальмонелл и шигелл при обследовании моллюсков в Греции [357].

Были сконструированы праймеры для детекции wee гена, входящего в состав кластера, ответственного за продукцию общего энтеробактериального антигена (ЕСА), который является типовым признаком для всех представителей семейства Enterobacteriaceae. Авторы предложили использовать эти праймеры для тестирования контаминации питьевой воды и пищи энтеробактериями на первом этапе исследования. В случае положительного результата предлагается проводить ПНР идентификацию энтеробактерий Е. coli 0157:Н7, Shigella spp, Salmonella spp и Yersinia spp.

Тайваньскими учеными разработан метод выявления малых количеств бактерий рода Shigella в природной воде. 50 мл воды фильтруют. Материал фильтра подвергают ПЦР. Чувствительность метода составила 270-8000 клеток на 50 мл воды [201].

Таким образом, несмотря на доминирование микробиологических методов, являющихся информативными и доступными, метод ПЦР достаточно широко используется в диагностике ОКИ [65]. Он незаменим при исследованиях большого количества проб продуктов питания, объектов внешней среды и материалов от больных при расследовании вспышечной и спорадической заболеваемости, для выявления штаммов, продуцирующих токсины и другие факторы патогенности, представляющие особую опасность.

Дата добавления: 2015-07-20