Амплификация фрагментов генома H.pylori.

Выявление H.pylori с использованием ПЦР тест-системы «Helicobacter» фирмы «Ниармедик» (Москва).

После адаптации тест системы (см. главу Формирование материальной базы для проведения исследований исследование проводили по следующей схеме:

1. Готовили в микропробирке объемом 1,5 мл (тип «Эппендорф») реакционную смесь, для этого смешивали в расчете на 1 исследование:

2,5 мкл 10-кратного буферного раствора;

1,5 мкл раствора БСА с концентрацией 17 мг/мл;

2 мкл смеси dNTP

4 мкл раствора праймеров - по 2мкл каждого,

3 мкл деионизованной воды.

2. Разносили реакционную смесь в 0,5 мл микропробирки по 16 мкл, согласно количеству исследуемых образцов и контролей.

3. Наслаивали на поверхность каждой реакционной смеси по 30 мкл стерильного вазелинового масла.

4. Вносили под масло по 7 мкл проб и контролей согласно маркировке.

5. Помещали смеси в амплификатор, денатурировали нагреванием при 95° С в течение 4 мин.

6. На стадии паузы добавляли в каждую пробирку по 2 мкл разведенной непосредственно перед употреблением бидистиллированной водой Tag- полимеразы (2 единицы активности).

7. Проводили амплификацию по следующей программе:

денатурация ДНК	94°С 1 мин.
отжиг праймеров	66°С 1 мин.	35 циклов
синтез фрагмента	72°С 2,5 мин.

Выявление Н.ру1оп с использованием ПЦР тест-системы «АмплиСенс- НеИсоЬа^ег ру1оп-520» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.

ПЦР-детекция Н.ру1оп с использованием ПЦР тест-системы «АмплиСенс-НеПсоЬайег ру1оп-520» ФГУН ЦР1ИИЭ Роспотребнадзора проводилась согласно инструкций производителя.

Выявление Н.ру1оп с использованием ПЦР тест-системы «Хеликопол II» фирмы Литех г. Москва.

ПЦР детекция Н.ру1оп с использованием ПЦР тест-системы «Хеликопол II» фирмы Литех г. Москва проводилась в соответствии с инструкциями производителя.

Амплификация гена CagA Н.ру1оп с помощью тест-системы «ДиаГен- НеИсоЬаМег» фирмы «Диагенис» г. Москва.

ПЦР детекция гена CagA Н.ру1оп с помощью тест-системы «ДиаГен- НеНсоЬас1ег» фирмы «Диагенис» г. Москва проводилась согласно инструкций производителя.

Амплификация гена УасА Н.ру1оН с использование набора «Хеликопол УА» фирмы Литехг. Москва.

После адаптации тест системы (см. главу Формирование материальной базы для проведения исследований исследование проводили по следующей схеме:

1. Готовили реакционную смесь для амплификации из расчета на 1 пробу: буфер — Змкл, аЫТР - 3 мкл,

праймеры (з1/з2, ш1, ш2) — 2 мкл, Тац-полимеразы - 0,2 мкл, дистилированной воды — 16,8 мкл.

2. После добавления Тац-полимеразы, которое производится в последнюю очередь тщательно перемешивали смесь пипетированием.

3. Добавляли по 25 мкл смеси во все пробирки, подготовленные для амплификации, наносили по 25-30 мкл минерального масла.

4. Вносили по 5 мкл анализируемых образцов и контролен в соответствующие пробирки под слой масла.

5. Центрифугировали в течение 3-5 сек при 1500-3000 об/мин и переносили пробирки в прогретый до температуры 94° С амплификатор.

6. Проводили амплификацию по следующей программе:

«горячий старт»	94°С 3 мин.	1 цикл
денатурация ДНК	94°С 1 мин. 52°С 1 мин. 72°С 2 мин.	30 циклов
отжиг праймера
синтез фрагмента
завершение синтеза	72°С 5 мин.	1 цикл

Амплификация фрагментов геномов возбудителей вирусных гепатитов. Использование ПЦР тест систем производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора для выявления вирусов гепатитов В, С, D, G, TTV и определения генотипов la, lb, 2, За ВГС.

Для ПЦР-детекции вирусов гепатитов В, С, D, G, TTV и определения генотипов la, lb, 2, За ВГС применялись тест-системы серии «АмплиСенс». Исследование проводили согласно инструкций разработчика. Амплификация фрагментов геномов возбудителей НУГИ. Использование ПЦР тест систем производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора для выявления U.urealyticum, М.hominis, С.trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II, папилломавирусов генотипов 16, 18,31,33,35,45

Применялись тест-системы серии «АмплиСенс». Исследование проводили согласно инструкций разработчиков.

Выявление продуктов амплификации методом электрофореза

Электрофоретическое разделение продуктов амплификации осуществлялось в соответствии с руководством. Маниатис с соавт [46]. Электрофорез проводили при напряжении 120В в течение 25 мин.

2.2. Результаты собственных исследований 2.2.1.Формирование материальной базы для проведения исследований

На момент начала наших исследований практическая ПЦР диагностика в Российской Федерации находилась на стадии становления, достаточного опыта работ не имелось, поэтому на исходном этапе значительное внимание было уделено решению ряда методических проблем - выбору приборной базы, методов подготовки клинического материала к исследованию, подбору и адаптации ПЦР тест-систем.

Дата добавления: 2015-07-20