Диагностика хеликобактерной инфекции

Helicobacter pylori был выделен и описан австралийскими учеными Уорреном и Маршаллом в 1983г. [366]. Они доказали его роль в формировании гастродуоденальной патологии. К самостоятельному роду Н.pylori был отнесен в 1989г. на основании данных ультраструктуры, биохимических, антигенных свойств и генотипических признаков [50]. Поскольку он выделен относительно недавно представляется целесообразным дать краткое описание его свойств и методов его изучения.

H.pylori - мелкие, неспорообразующие, грамотрицательные, оксидазо- и каталазо-положительные, продуцирующие большое количество уреазы, микроаэрофильные бактерии изогнутой, S-образной или слегка спиральной формы. Толщина клетки бактерии 0,5—1,0 мкм, длина 2,5—3,5 мкм. Клетка покрыта гладкой оболочкой, на одном из полюсов имеет 1—6 мономерных жгутиков длиной 5-10 мкм. [12, 86]

Геном H.pylori невелик - 1600 генов [352]. Содержание гуанина и цитозина в ДНК - 35-37 мол %. По этому признаку он дифференцируется от кампилобактеров. В их ДНК % ГЦ оснований составляет 31-32 [86].

Существующие в настоящее время методы диагностики хеликобактерной инфекции могут быть разделены на две группы - инвазивные и неинвазивные. Инвазивные методы предусматривают проведение эндоскопического исследования с отбором биопсийного материала [144]. Следует отметить, что методики, базирующиеся на эзофагогастродуоденоскопии, подвержены случайностям из-за неравномерного распределения клеток H.pylori по гастродуоденальной слизистой. Для предотвращения ложноотрицательных результатов используют множественную биопсию. При этом соскобы делают не только в антральном отделе, но и в теле желудка. Рекомендуется брать биоптаты в 5-7 участках. [231]

К неинвазивным методам диагностики хеликобактериоза относятся иммунологические исследования, позволяющие определять наличие антител в сыворотке крови, а также уреазные дыхательные тесты и «аэротест» [111]. По поводу неинвазивности иммунологических методов можно дискутировать, так как для них необходим отбор крови. Эти методы используются, главным образом, в эпидемиологических исследованиях с целью изучения распространения инфекции, ассоциированной с H.pylori.

Бактериологический метод.

Бактериологический метод заключается в выделении чистой культуры H.pylori из биоптатов, желудочного сока и дальнейшего ее изучения. Бактерии растут в микроаэрофильных условиях при составе газовой смеси: азот - 85-87%, кислород - 5%, углекислый газ - 8-10%. В аэробных и строго анаэробных условиях хеликобактер не растет. Оптимальная температура 37°С. Многие штаммы H.pylori развиваются при температурах: 33-35° С и 40­41° С, но не растут при 25-28°С и 42°С и выше. Н. pylori культивируют на богатых питательных средах - средах с добавлением крови, "шоколадном агаре" и других (Колумбия-агар, среда Мюллер-Хинтона). На плотной питательной среде через 48-72 часа образуются прозрачные мелкие колонии диаметром 1мм. В жидкой среде рост не заметен, для культивирования требуется постоянное перемешивание [86]. Бактериологическое исследование позволяет определить морфологические, культуральные, биохимические, антигенные свойства, антибиотикорезистентность и факторы патогенности хеликобактера. Для проверки эрадикации H.pylori повторный посев производится через 4 недели после завершения лечения.

Бактериологический метод имеет 100% специфичность [264]. Чувствительность от оснащенности лаборатории и квалификации персонала. H.pylori «капризен», требует специальных условий культивирования, дорогостоящего оборудования и сред для транспортировки и культивирования. Все это делает бактериологический метод детекции хеликобактера малодоступным для практических лабораторий.

Морфологические методы.

Эти методы получили наиболее широкое использование в практике. К ним относятся изучение парафинизированных срезов (гистологический метод) и микроскопия мазков отпечатков (цитологический метод).

Гистологический метод выявления H.pylori ряд авторов считает «золотым стандартом» диагностики хеликобактериоза. Его специфичность составляет 81-97%, чувствительность - 72-100% [4, 34, 70]. Производится прямая визуализация микроорганизма. Специальные окраски: серебрение по

Вартину-Старри, окрашивание по Гимзе, Генте, Граму, акридиновым оранжевым, толуидиновым синим повышают вероятность микроскопической идентификации. Метод имеет ряд преимуществ, таких как широкая доступность, удобство хранения и транспортировки препаратов, возможность оценки состояния слизистой оболочки желудка. Наиболее точная картина поражения получается при изучении не менее 5 биоптатов. Содержание H.pylori в препаратах можно оценить количественно.

Минусом теста является его субъективность. Приходится на глаз отличать кокковую форму хеликобактера от кокковых форм других бактерий и другие спиралевидные микроорганизмы от H.pylori. Ограничения гистологического метода связаны с этапом отмывания биоптата. Небрежность на этой стадии влечет занижение концентрации H.pylori при оценке обсемененности, а при исходно низком содержании бактерий - к получению ложноотрицательного результата [55]. Кроме того, гистологический метод продолжителен, только подготовка препаратов к исследованию занимает 5-7 дней. Для проведения гистологической диагностики хеликобактериоза требуется квалифицированный персонал с большим опытом морфологических исследований.

В начале 90-х годов было предложено использовать микроскопическое исследование мазков отпечатков биоптатов, окрашенных по Грамму в качестве простого, быстрого (5 мин) способа диагностики хеликобактерной инфекции [3, 130]. В настоящее время этот метод один из основных при выявлении хеликобактера в практических лабораториях. Значительное преимущество цитологического метода заключается в том, что им регистрируется более высокая обсемененность слизистой оболочки H.pylori, чем в гистологическом исследовании. Это обусловлено меньшими потерями инфекционного агента на стадии подготовке препарата [54].

По способу получения препарата различают ряд вариантов метода: - «crush cytology» — раздавливание биоптата;

- «touch cytology» («imprint cytology») - прикосновение и отпечаток люминальной поверхности биоптата к предметному стеклу;

- «brush cytology» - получение препарата пристеночной слизи.

Выявление H.pylori цитологическим методом в желудочном соке, полученном натощак, имеет низкую чувствительность и специфичность, поэтому в настоящее время не применяется [27].

Проведенные исследования выявили, что «brush cytology» является наиболее приемлемым вариантом морфологической диагностики H.pylori- инфекции. Метод прост, недорог, имеет высокую чувствительность. Он особенно эффективен при низкой обсемененности и при контроле эрадикации H.pylori [56]. Чувствительность этого варианта составляет 80­90%, а специфичность по мнению отдельных исследователей может достигать 100% [41].

Главным недостатком цитологического метода, как и гистологического, является субъективность, в связи, с чем достижение 100% специфичности представляется маловероятным.

Быстрый уреазный тест.

H.pylori — уникальный продуцент уреазы. Поэтому, ряд методов его выявления основан на определении активности этого фермента. Для быстрой детекции хеликобактера биоптат помещают в среду с мочевиной и индикатором. При наличии уреазы из мочевины образуется аммоний, что меняет рН среды и цвет индикатора. Тест корелирует с результатами выделения чистой культуры H.pylori, совпадение отмечается более чем в 90% случаев [73]. Он прост, не требует особой квалификации медицинского персонала, относительно дешев, позволяет быстро получить ответ. Чувствительность теста составляет 65-95 %, а специфичность — 75-100 % [34, 73]. Недостатком быстрого уреазного теста является высокая вероятность ложноположительных результатов, что может быть связано с контаминированием материала другими уреазопродуцентами. При малом количестве H.pylori возможен ложноотрицательный результат, поскольку изменение окраски происходит через несколько часов.

Уреазные дыхательные тесты.

На уреазной активности H.pylori также основаны изотопные методы диагностики - дыхательные тесты с мочевиной, меченной изотопами углерода ¹³С, ¹⁴С. Меченая мочевина дается пациенту в составе пробного завтрака. При разложении мочевины уреазой выделяется углекислый газ, содержащий изотоп углерода. Газ с кровотоком доставляется в легкие и выводится при выдохе. На основе анализа изотопного состава выдыхаемого воздуха, делают заключение об инфицированности H.pylori [39].

Работа с радиоактивным изотопом углерода ¹⁴С ограничена и строго контролируется, поэтому этот вариант метода используется редко. Дыхательный тест, с мочевиной, меченной нерадиоактивным изотопом ¹³С, нашел более широкое применение [63]. Дыхательные тесты объективны - не зависят от правильности забора материала, интегративны - дают представление о всей слизистой оболочке, а не об отдельном ее фрагменте. Поэтому в странах, где освоена эта методика, она рекомендуется для контроля эффективности эрадикации H.pylori, эпидемиологических исследованиях больших контингентов населения, обследования детей.

1 о

Изотоп "СО. выявляется масспектрометром. Высокая стоимость этого прибора ограничивает внедрение ^,3С дыхательного теста. Имеются варианты регистрации ¹³С02 с использованием лазерной технологии [28].

Основным недостатком этого теста индикации H.pylori является высокая вероятность получения ложноположительного результата, обусловленная наличием в пищеварительном тракте других бактерий, продуцирующих уреазу

Серологический метод.

Проникновение H.pylori в организм вызывает системный иммунный ответ. В сыворотке крови пациентов обнаруживаются антитела классов М, G, А, направленные против различных бактериальных антигенов хеликобактера.

Среди методов серологической диагностики Н.ру1оп наиболее широкое распространение получил ИФА [78, 264]. Одно из его преимуществ — определение факта инфицирования не только при манифестной, но и при субклинической форме инфекции и на стадии ремиссии заболевания. Чувствительность метода 87 - 98%, специфичность - 75 - 100% [74, 86].

Серологический метод может дать ложноположительные и ложноотрицательные результаты [73]. Они объясняются следующими причинами:

-за счет трансплацентарной передачи антител серопозитивными могут оказаться неинфицированные Н.ру1оп новорожденные;

-серопозитивность может быть при узелковой гиперплазии слизистой оболочки желудка и отсутствии возбудителя;

- тест на антитела отрицателен 18-60 дней с момента заражения до развития гуморального ответа;

- тест на антитела положителен в течение месяца после эррадикации возбудителя.

Наличие антител к Н.ру1оп в крови не свидетельствует однозначно об активной хеликобактерной инфекции. Только количественный вариант иммуноферментного анализа и сравнение уровня антител после лечения с исходным уровнем, позволяет сделать определенные выводы. Однако, следует учитывать, что через 6 недель после завершения лечения уменьшение титра антител к Н.ру1оп наблюдается и при успешной терапии, и при персистировании инфекции. Информативным считается падение титра антител более чем на 50% через 6 месяцев после окончания терапии [354]. Полугодовое ожидание результата лечения, сложность организации отбора и хранения двух проб крови, меньшая доступность количественных методов ИФА не позволяют рекомендовать этот метод для контроля эррадикации Н.ру1оп. ИФА может быть использован при проведении эпидемиологических исследований. Его применение в клинической практике определяется индивидуально в конкретной ситуации.

Разработаны «настольные» тесты для обнаружения антител к H.pylori. Они основаны на латекс-агглютинации или твердофазном ИФА. Исследуется капля крови, взятая из пальца. Результат теста читается через 1-2 минуты, дополнительного оборудования не требуется. Несмотря на уникальную простоту выполнения, место этих методик в диагностике H.pylori-инфекции пока не определено. Возможно, они найдут применение в небольших больницах или амбулаториях, где потребность в иммунологической диагностике ограничивается единичными анализами [60].

Имеются методики определения антител к H.pylori в слюне и в кале, возможности их использования для целей практической диагностики интенсивно изучаются [213].

Полимеразная цепная реакция.

В диагностике хеликобактерной инфекции активно используются молекулярно-биологические методы исследования. В основном они представляют собой различные модификации ПЦР, позволяющие обнаружить специфичные для Н. pylori гены (16SpPHK, UreA, UreB, UreC, CagA, VacA и др).[141, 332]

Для диагностики инфекции, ассоциированной с H.pylori, метод ПЦР был впервые применен в 1990г. Hoshina и др. В своей работе авторы сконструировали праймеры к высококонсервативному видоспецифичному гену H.pylori 16SpPHK [141]. В дальнейшем многие исследователи также использовали последовательность этого гена для выявления хеликобактера [337,351].

В ряде других работ для выявления H.pylori использовались праймеры к генам иге, кодирующим различные субьединицы уреазы [110, 143]. Создана ПЦР тест система для выявления хеликобактера, основанная на принципе «Nest-PCR». Мишенью является высококонсервативный ген Hsp60 белка теплового шока. Новая система показала преимущества в чувствительности и специфичности перед ПЦР на 16S rRNA ген, ureC ген [334]

Метод ГТТДР позволяет выявлять возбудителя хеликобактерной инфекции как в образцах биолтатов слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки, так и в желудочном соке, желчи, слюне, содержимом зубных карманов, фекалиях, что делает этот метод весьма привлекательным для практических исследований [238, 255, 256, 334, 339, 375].

Кроме этого, метод ПЦР незаменим в научных исследованиях H.pylori. Он дает возможность типировать и дифференцировать штаммы, проводить эпидемиологические исследования инфекции, отличать случаи реинфекции от рецидива инфекции, определять механизмы антибиотикорезистентности [161, 274]. Методом ПЦР было показано, что устойчивость H.pylori к макролидам обусловлена точечной мутацией в 23SpPHK гене [100, 251]. Разработана мультиплексная тест-система, основанная на «Real time PCR» и измерении температуры плавления ампликона, для выявления пациентов, инфицированных H.pylori, определения мутаций устойчивости к кларитромицину и детекции генов факторов патогенности H.pylori cagA и vacA [101].

Показана возможность выявления H.pylori методом ПЦР в объектах внешней среды - сточной воде и питьевой воде. В США разработаны тест системы на основе «Real time PCR», одна с использованием интеркалирующего агента Sybre Green [280], вторая с использованием праймеров TaqMan [328] в 100 раз чувствительней обычной ПЦР. Они способны выявлять 2-28 клеток H.pylori в пробе, в том числе и некультивируемые, но жизнеспособные формы микроорганизма. При исследовании 23 образцов сточных вод в 84 % из них был выявлен H.pylori, параллельно при использовании традиционного варианта ПЦР получены отрицательные результаты [280].

В сравнительных экспериментах установлено преимущество метода ПЦР над иммуногистохимическим методом в чувствительности и специфичности при диагностике хеликобактерной инфекции [370].

Французские исследователи на 518 пробах биоптатов провели выявление

H. pylori гистологическим методом и методом ПЦР. Чувствительность и специфичность для ПЦР составила 98.2 % и 97.5 соответственно, а для гистологического метода - 87.7 % и 91.3 % [345].

Учитывая малую вероятность широкого внедрения микробиологического исследования в практическую диагностику хеликобактерной инфекции, можно расценивать ПЦР как наиболее перспективный, эффективный и доступный из методов специфической детекции хеликобактера. В связи с этим, представляется крайне актуальным и важным освоение, оптимизация и активное внедрение в работу практических лабораторий методов диагностики H.pylori-инфекции, основанных на технологии ПЦР.

I. 2.3. Диагностика парентеральных вирусных гепатитов. Парентеральные вирусные гепатиты - группа инфекционных

заболеваний печени, основными этиологическими агентами которых являются не родственные между собой вирусы гепатита В (сем. Hepadnoviridae) и гепатита С (сем. Flaviviridae). Вирусный гепатит В может быть осложнен вирусом-сателлитом Д (дельта), который способен развиваться только в присутствии вируса гепатита В.

Для постановки диагноза вирусный гепатит учитываются следующие факторы:

-показатели активности печеночных ферментов; -наличие маркеров вирусов гепатитов, -эпидемиологический анамнез; -результаты клинического осмотра пациента.

Безусловно решающим для постановки диагноза является обнаружение маркеров вируса. Вирусы гепатитов В и С не культивируются в лабораторных условиях. В связи с этим, их выявление основано на обнаружении компонентов вирусов (белков, нуклеиновых кислот) или антител к антигенам вирусов.

Диагностика вирусного гепатита В.

Выявление вируса гепатита В базируется в основном на иммунологических методах. Наиболее значимым и часто применяемым в практике является исследование на наличие HBs антигена вируса гепатита В, который является главным маркером этого инфекционного агента. Тест на HBs антиген используется при выявлении первично инфицированных, бессимптомных носителей, оценки эффективности лечения, проверки доноров и пулов донорской крови. Впервые HBs антиген был выявлен в реакции преципитации в геле [122]. Следующим этапом совершенствования диагностики гепатита В стало внедрение методов встречного иммуноэлектрофореза и реакции обратной пассивной гемагглютинации, чувствительность которых достигала 400 и 20 нг/мл соответственно [90].

В настоящее время в качестве метода выявления HBs антигена используются различные модификации твердофазного ИФА. В большинстве тест-систем применяется схема одностадийного «сэндвича». Современные планшетные тест-системы позволяют выявить ad и ау субтипы HBs антигена в концентрации до 0,05 нг/мл [90].

Разработаны экспрессные, безинструментальные тесты на HBs антиген, основанные на твердофазном ИФА - «Flow through», «Lateral flow», «Immunocomb HBsAg», которые позволяют получить результат за несколько минут без использования сложного оборудования. Однако их чувствительность составляет 0,5-5 нг/мл. Несмотря на низкую чувствительность, они нашли свою область применения. Экспресс тесты используют, когда применение высокочувствительных методов невозможно из-за ограничений по времени, например при необходимости экстренного переливания крови [57].

Радиоиммуный метод выявления НВэ антигена используется достаточно редко, хотя и имеет высокую чувствительность — 0,05 нг/мл. Ограничения обусловлены использованием радиоактивной метки [90].

В последние годы разработаны тест системы и оборудование для выявления НВб антигена хемилюминисцентным методом (разработки фирм «Рош диагностик», «ОМБ». Чувствительность метода составляет 0,05 нг/мл.

Несмотря на высокую специфичность современных тест-систем, не исключается получение ложно-положительных результатов. Это может быть связано с неспецифическим взаимодействием компонентов реакционной смеси и сывороток крови, с бактериальным загрязнением и другими факторами. С целью подтверждения правильности выявления НВэ антигена используют тест нейтрализации. Для этого антиген пробы нейтрализуют аттестованной анти- НВэ сывороткой. После чего проводят повторный тест, который в случае правильного определения НВб -антигена должен быть отрицательным. Проведение теста нейтрализации обязательно в диагностическом исследовании.

Определение анти — НВя антител. Выявление анти — НВб антител является важным тестом, поскольку позволяет проверять эффективность вакцинации против гепатита В. По международному стандарту, выраженному в мили (международных единицах на миллилитр- шШ/т1), протективный уровень анти — НВз антител должен быть не ниже 10 тШ/ш1. Для количественного определения анти — НВэ антител применяют тест- систем на основе твердофазного ИФА, где в качестве конъюгата используется меченый высокоочищенный НВб -антиген [90]. Имеются тест- системы для выявления анти — НВэ антител, основанные на хемилюминисцентном методе [203].

Определение HBcorAg и антител HBcorAg не часто проводят в практической диагностике вирусного гепатита В. Соответствующие ИФА тест-системы производятся и используются в основном в научно- исследовательских работах. Наибольшее значение имеет выявление антител класса IgM к НВс антигену. Наличие таких антител свидетельствует об имеющейся или прошедшей активной репликации вируса [90].

Выявление HBeAg и антител к HBeAg представляется важным, поскольку это связано с существованием мутантных форм ВГВ. HBeAg и анти HbeAg рассматриваются как суррогатные серологические маркеры Рге- соге - мутантов ВГВ [69]. Для выявления используется «сэндвич» ИФА. Исследования на присутствие HbeAg проводят при наличии HBs антигена. В сыворотках крови, содержащих HBs антиген, в большинстве случаев удается выявить HBeAg и антитела к нему. В качестве подтверждающего теста используется тест нейтрализации HbeAg.

Определение ДНК вируса гепаита В.

Для выявления ДНК вируса гепатита В исходно использовались методы ДНК-зондов: гибридизация «Дот-блот»; жидкостная гибридизация с выделением образовавшегося комплекса на колонке (тест-система фирмы «ABBOTT») [230, 393]. Чувствительность этих методов - 6х10⁶ частиц вируса/мл.

Более совершенным является метод, получивший наименование гибридизация с использованием разветвленных зондов (branch assay). В процессе реакции происходит многократное присоединение друг к другу зондов, меченных ферментом, окисляющим субстрат и запускающим хемилюминисценцию. С присоединением каждого зонда происходит амплификация сигнала люменисценции. Чувствительность разветвленной гибридизации 7x10⁵ частиц/мл [192]. Метод гибридного захвата (hybrid capture) для выявления ДНК ВГВ основан на связывании продукта гибридизации вирусной ДНК и РНК - зонда с моноклональными антителами. Использование флуоресцентной метки позволило повысить чувствительность метода до 4,7x10³ - 5,6x10⁷ частиц/мл [193, 298].

На современном этапе ДНК вируса гепатита В выявляется, как правило, тест-системами, использующими принцип ПЦР. Промышленный диагностикум «Amplicor HBV monitor» фирмы «Roche diagnostics», где используются меченые праймеры, позволяет выявлять продукт амплификации при помощи ИФА. Он имеет чувствительность 4x10" частиц/мл [244]. Использование технологии «PCR real time» (варианты: TaqMan, molecular becons, интеркалирующие агенты) позволяет более точно проводить оценку концентрации вируса и повысить чувтвительность до 50­100 частиц/мл. [64,68,69,73]. Для этих методов характерен также широкий линейный диапазон выявления вирусной ДНК (от 100 до 10¹⁰ копий) и успешная детекция вирусов, относящихся к различным генотипам [239, 372]. Ряд тест-систем, основанных на технологии «PCR real time», сопряжены с различными типами автоматизированных систем выделения нуклеиновых кислот из сыворотки и плазмы крови [117, 195, 398].

Благодаря ПЦР стало возможным проведение генотипирования вирусов гепатита В. В ряде работ ПЦР является первой стадией исследования и используется для получения информативного фрагмента генома вируса. Определение генотипа осуществляется рестрикционным анализом фрагмента или его секвенированием [137, 153]. Кроме того, разработаны мультиплексные ПЦР тест-системы, позволяющие одновременно определять наличие вируса и устанавливать его генотип [138, 242].

Важной проблемой, связанной с терапией гепатита В, является обнаружение вариантов вируса, устойчивых к противовирусным препаратам. Для ее решения созданы ПЦР тесты для выявления различных вариантов мутаций, вызывающих устойчивость к ламивудину [365, 373, 388, 397]. С использованием метода ПЦР выявлены так же мутации, приводящие к изменению HBs антигена вируса гепатита В. Такие мутантные формы вируса не могут быть обнаружены тест-системами на HBs-антиген. Для их детекции могут быть применены методы, выявляющие вирусную ДНК [200, 292].

Перспективны для выявления ДНК ВГВ и другие технологии, использующие принцип амплификации нуклеиновых кислот - транскрипционная амплификация (NASBA) и лигазная цепная реакция (ЛЦР). Так, в экспериментах транскрипционная амплификация более чем в 100 раз превосходила гибридизационные технологии и позволяла с высокой линейностью результатов выявлять ДНК ВГВ в интервале от 5x10 до 5x10 копий/мл. Метод может быть с успехом использован для определения вирусной нагрузки [216]. Тест система, основанная на приципе лигазной цепной реакции фирмы «ABBOTT», успешно применяется для детекции ДНК мутантных форм ВГВ [219].

Таким образом, несмотря на наличие широкого круга информативных, высокочувствительных и специфичных иммунологических тестов методы, основанные на выявлении ДНК, нашли широкое применение в диагностике гепатита В. В основном, они используются для проверки эффективности терапии гепатита, определения генотипа вируса, контроля за образованием резистентных форм вируса и вирусов с измененным HBs антигеном. Дискутируется вопрос о целесообразности проверки донорской крови на ВГВ с использованием метода ПЦР. Поскольку отмечен случай заражения реципиента кровью, показавшей отрицательный результат в тестах на HBsAg и антитела к HBcorAg [103, 140]. Ретроспективный анализ методом «nest- ПЦР» показал наличие ДНК ВГВ. Повторная донация при проверке была положительна на HBsAg и antiHBcor. Очевидно, донор находился в пресероконверсионной, ранней стадии заболевания, когда уровень HBsAg ниже детектируемого [103].

Диагностика вирусного гепатита Дельта.

На практике достаточно редко проводят выявление свободного дельта антигена, поскольку в процессе развития инфекции он присутвует в крови ограниченное время. Как правило, он выявляется в составе дельта-вируса. Для этого проводят обработку исследуемого материала детергентами, после чего антиген выявляют в твердофазном варианте ИФА.

Для обнаружения антител ВГБ классов IgG и IgM разработаны диагностические препараты для ИФА и РИА. Используемые схемы проведения реакции аналогичны схемам выявления антител к НВсог антигену классов G и М. Очищенный дельта антиген, используемый в диагностикумах, получают при помощи генно-инженерных технологий [90].

Так же, как и при лабораторной диагностике гепатита В для постановки диагноза дельта-гепатита применяются методы обнаружения РНК ВГО, основным из которых является ОТ-ПЦР [134]. Разработаны варианты тест- систем «PCR real time» Они использованы разработчиками для определения вирусной нагрузки у больных и изучения динамики ответа на терапию. Показаны высокая чувствительность метода, способность его выявлять ВГО различных генотипов [233, 395]. Разработана мультиплексная ПНР тест система для одновременной детекции ДНК ВГВ и РНК BFD с определением продуктов амплификации гибридизацией на биочипе [95] и вариант ПЦР для генотипирования BTD [348].

Диагностика вирусного гепатита С.

Этиологическая диагностика ВГС стала доступной относительно недавно. В 1989 году был клонирован геном вируса и получены иммунореактивные олигопептиды, взаимодействующие с антителами крови больных гепатитом С. Это сделало возможным разработку диагностикумов к ВГС. Основным методом детекции стал метод ИФА. Многообразие антигенов, кодируемых геномом ВГС, позволило разработчикам апробировать широкий спектр полипептидов. Созданы тест-системы трех поколений. В первых диагностикумах использовались два полипептида: пептид 5-1-1 (кодируемый зоной NS4 генома) и пептид С100-3 (кодируемый зоной NS3 генома). Они позволяли выявить до 70-80% носителей ВГС. Антитела к ВГС системами первого поколения определялись через 30-90 дней после появления желтухи. В современных диагностикумах применяются четыре пептида: С22-3 (Core область генома); С200 (NS3 и NS4 области генома); СЗЗс (NS3 область генома); и пептид, кодируемый NS5 областью генома. Эффективность выявления носителей ВГС этими системами составляет 97%, антитела определяются через 7-10 дней после начала желтухи [181].

Спектр выявляемых антител зависит от стадии гепатита С. Первыми обнаруживаются антитела к белкам, кодируемым Core и NS5 зонами генома. Антитела к белкам, кодируемым NS4-3onoft, в острую фазу заболевания отсутствуют [5].

Имеются тест-системы для выявления анти-ВГС класса IgM. На стадии разработки апробировались различные пептиды. Для производства используется вариант, кодируемый Core регионом. Однако диагностическая роль теста на антитела IgM к ВГС оказалась не столь высока, как выявление IgM антител при ВГА и ВГВ, поскольку они выявляются достаточно часто как при остром, так и при хроническом ВГС [309] и тест не может служить маркером острого гепатита С.

Одной из наиболее важных проблем при выявлении антител к ВГС является высокая частота ложноположительных результатов (10-20%) [326]. Они связаны с неспецифическим взаимодействием компонентов реакции, перекрестными реакциями с другими антигенами и рядом иных факторов. Чаще всего ложноположительные результаты наблюдаются при обследовании больных с онкологическими и аутоиммунными заболеваниями, лиц с иммунодефицитами и больных сифилисом [193, 338].

Для подтверждения правильности положительного результата используют иммуноблотинг. Антигены, кодируемые разными участками генома ВГС, отдельными полосами наносят на нитроцеллюлозный фильтр. Связывание анти-ВГС с сорбированными антигенами выявляется антителами против IgG человека, меченными ферментом.

Активно ведётся разработка тест систем для выявления антигенов ВГС. Созданы диагностикумы на основе твердофазного ИФА для выявления Сог- антигена ВГС. Тест показал высокую специфичность, чувствительность. Он перспективен для применения в службе переливания крови [107]. Установлены возможность специфичного выявления Cor-антигена в сыворотке и плазме крови; наличие циркуляции Cor-Ag у серонегативных по анти-ВГС лиц; высокая частота (90,3%) выявления Cor-Ag в сыворотках крови, содержащих антитела к ВГС и РНК ВГС; прямая корреляция между концентрацией РНК ВГС и частотой выявления Cor-Ag. Исследования на Cor-антиген позволяют сократить фазу «серонегативного окна». По данным ряда авторов Cor-Ag выявляется в 83% случаев на следующий день после первого обнаружения РНК ВГС и задолго (в среднем за 26 дней) до появления антител к ВГС [107, 301].

Методы обнаружения РНК ВГС. Гибридизационные методы выявления РНК ВГС использовались главным образом в варианте «гибридизация in situ» для идентификации вируса непосредственно в клетках. Вирус был выявлен в гепатоцитах, мононуклеарах крови, клетках слюнных желез [109, 271]. Выявление в гибридизации негативных (репликативных) цепей РНК ВГС свидетельствовало об активной репликации вируса [132, 284]. Наиболее совершенные гибридизационные диагностикумы, используемые в настоящее время базируются на технологии разветвленных зондов (Branched DNA assay фирмы «Bayer») и выявляют 2500 копий РНК ВГС.

Метод ПЦР широко применяется для выявления РНК ВГС как за рубежом, так и в России. Мишенью является участок 5'-нетранслируемой области генома как наиболее консервативный (92-98% гомологии нуклеотидов между вирусами разных генотипов и 98-99% гомологии в пределах генотипа). Использование праймеров, меченых ферментом, позволяет проводить детекцию ампликонов методом ИФА. Применение гибридизации с олигонуклеотидом для обнаружения ампликона увеличивает чувствительность и специфичность метода. Для повышения чувствительности и специфичности может быть использована «гнездовая ПЦР». Однако, при ее применении возрастает риск контаминации и получения ложно-положительных результатов [317]. Открытие и использование термостабильных полимераз с ревертазной активностью (ТТН-ДНК-полимераза) позволило создать тест-системы, в которых стадии обратной транскрипции и ПЦР проводятся последовательно в одной пробирке в одной реакционной смеси [347].

Опыт применения ПЦР диагностикумов, созданных в научных лабораториях (так называемых домашних тестов — «in house tests») выявил значительную вариабельность их чувствительности и специфичности и отсутствие воспроизводимости результатов [146].

Стандартизованные наборы («Roche Diagnostics Systems» США; «Интерлабсервис» Россия) выявляют 100-1000 копий/мл РНК ВГС. Наличие в них внутренних контрольных образцов позволяет избежать ложноотрицательных результатов, а использование систем антиконтаминационной модификации ампликонов снижает вероятность получения ложноположительных результатов.

Одним из наиболее перспективных методов выявления РНК ВГС является метод ПЦР в реальном времени «PCR real time». Разработаны и активно применяются варианты, основанные на принципах TaqMan и molecular becons [187, 273, 277, 306, 320]. Для этих систем характерен широкий линейный диапазон выявления вируса от 10 до 10⁹ копий/мл, возможность количественной оценки вирусной нагрузки, эффективное выявление вирусов, относящихся к разным генотипам, быстрота исследования, автоматизация процесса [268, 297]. Однако, имеются сообщения, что одна из наиболее популярных коммерческих систем «PCR real time» COBAS TaqMan («Roshe»,CILIA) с высокой чувствительностью выявляет варианты ВГС генотипа 1, но уступают по чувствительности и эффективности детекции вирусов генотипов 2, 3, 4 системе фирмы «Bayer», ФРГ, основанной на методе разветвленных зондов [171, 174].

Одной из важных проблем, решаемой методом ПЦР, является генотипирование ВГС. Определение генотипа вируса имеет не только теоретическое значение, оно необходимо для назначения адекватной терапии. Поскольку показано, что для подавления развития ВГС, относящегося к генотипу 1Ь, требуются более высокие концентрации противовирусных препаратов и более продолжительный период их введения. Для определения генотипа ВГС к настоящему времени разработаны «PCR real time» мультиплексные системы. Они позволяют одновременно выявлять РНК ВГС и дифференцировать 4-6 генотипов [145, 240, 269]. Продолжается разработка методов генотипирования, базирующихся на традиционных вариантах ДНК-диагностики. Группой канадских исследователей предложена технология определения генотипа ВГС гибридизацией с олигонуклеотидами. Продемонстрирована высокая надежность метода, способность выявлять каждый из генотипов при смешанном инфицировании, невысокая стоимость исследования [105].

Совершенствуются методы непосредственного обнаружения РНК ВГС в гепатоцитах печени. Отечественными учеными создан метод ПЦР in situ, позволяющий выявлять вирус, как в ядре, так и в цитоплазме гепатоцита [343]. Во Франции разработана высокочувствительная система детекции минус цепи РНК ВГС для определения активности репликации вируса в клетках печени. Она базируется на технологии «nested ПЦР». При этом вторая стадия амплификации проводится в режиме реального времени. Достигнута чувствительность 25 копий в пробе даже в присутствии 10⁵ копий плюс цепи [133].

Технологии, базирующиеся на выявлении РНК, играют существенную роль в диагностике и изучении вирусного гепатита С. Они являются основными методами выявления компонента вирусной частицы и используются для определения вирусной нагрузки при назначении терапии и контроле эффективности лечения. Выявление белковых антигенов вируса, хотя и является менее затратным, чем ОТ-ПЦР, пока не нашло широкого применения, поскольку уступает в чувствительности методам детекции вирусной РНК.

Благодаря методу ПЦР были разработаны варианты генотипирования ВГС, доступные для практических лабораторий. Внедрение методов РНК диагностики позволили усовершенствовать методическую базу контроля

контаминации донорской крови [140, 199, 327] и проводить более эффективную профилактику вертикального пути передачи ВГС [305]. 1.2.4 Диагностика НУГИ.

НУГИ - группа инфекционных клинически полиморфных заболеваний мочеполовой системы человека, вызываемых вирусами, бактериями родов Chlamydia, Mycoplasma, Ureaplasma и их ассоциациями. Возбудители НУГИ, исключая хламидии, являются условно патогенными микроорганизмами [11, 15, 17, 18].

НУГИ - широко распространенные заболеваниями, передающиеся преимущественно половым путем. Источником инфекции служит больной человек или бессимптомный носитель. Восприимчивость к возбудителям НУГИ высокая и приближается к 100%. Заболевания характеризуются склонностью к хронизации, персистенции, часто регистрируются бессимптомные формы. У лиц, перенесших НУГИ, стойкого иммунитета не вырабатывается [17, 18, 35].

Клинические проявления многообразны. У женщин возбудители НУГИ вызывают уретриты, циститы, вагиниты, кольпиты, эндометриты, сальпингиты, оофориты; у мужчин - уретриты, циститы, простатиты, эпидидимиты, орхиты, проктиты [1 1, 35, 53]. Связи между видом возбудителя и формами патологии не прослеживается, что затрудняет клиническую диагностику НУГИ [11, 15, 17].

Решающую роль при постановке диагноза имеют результаты лабораторных исследований. Однако лабораторная диагностика НУГИ осложняется тем, что вирусы герпеса, папилломавирусы, хламидии и микоплазмы являются труднокультивируемыми или некультивируемыми микроорганизмами, и, как правило, не выявляются бактериологическими и вирусологическими методами [20, 49].

Данный раздел посвящен анализу методов выявления наиболее распространенных и клинически значимых возбудителей НУГИ: Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II типов, Papillomavims, C.trachomatis,

M.hominis, U.urealyticum. Рассмотрены как классические методы, базирующиеся на культивировании и микроскопии, так и современные методы, основанные на технологиях ПИФ, ИФА, ПЦР и ряде других.

Методы выявления вирусов семейства Herpesviridae.

Herpes simplex virus I и II типов относится к подсемейству Alphaherpesviridae. Его капсид 100 нм в диаметре, состоит из 162 капсомеров. Геном представлен линейной двухцепочечной ДНК размером 96 МДа. [31]. Род Cytomegalovirus относится к подсемейству Betaherpesviridae. Капсид ЦМВ 120-150 нм в диаметре, как и капсид ВПГ, состоит из 162 капсомеров. Геном также представлен линейной двухцепочечной ДНК, но размеры его больше - 145 МДа [17, 31].

С ВПГ 1 ассоциируются следующие формы инфекций: лабиальный герпес, герпес кожи и слизистых, офтальмогерпес, генитальный герпес, герпетический энцефалит, пневмонии; с ВПГ II - генитальный герпес и неонатальный герпес; с ЦМВ - врожденное поражение ЦНС, ретинопатия, пневмопатия, гепатит [17, 26, 31, 35].

Выявление ВПГ I/II и CMV, основанное на визуализации вирионов и морфологических изменений в пораженных тканях.

Для экспресс-диагностики герпетической инфекции с 1972 г. используется электронная микроскопия [31]. Препарат для просмотра готовится из содержимого везикул или из жидкой фракции растертых в дистиллированной воде корочек с засохших везикул. В качестве контрастера используется фосфорно-вольфрамовая кислота. Возможно определение концентрации вирусных частиц по методу «loop drop». Дифференциация ВПГ I/II от других морфологически неотличимых вирусов данного семейства может быть выполнена при использовании иммунной электронной микроскопии [17, 35].

Имеются методы обнаружения ВПГ I/II и ЦМВ, основанные на световой микроскопии [31, 35]. Для выявления ВПГ I/II готовят препараты из содержимого везикул, соскобов со дна эрозии, слизистой уретры, стенок влагалища, цервикального канала, крови, биопсийного материала. При исследовании на ЦМВ инфекцию готовят препараты из осадков слюны и мочи, содержимого цервикального канала, спермы, грудного молока, ликвора. Препараты готовят и окрашивают: по Папаниколау; Селлеру- Павловскому; Романовскому - Гимзе [31, 35]. Цитологические методы доступные, быстрые и дешевые. Однако, они неспецифичны, субъективны, результат оценки препарата зависит от опыта исследователя, уровня его профессионализма.

Методы выявления ВПГ I/II и ЦМВ, основанные на культивировании вирусов.

ВПГ I и ВПГ II культивируются на ряде культур эукариотических клеток: Vero, Hela, ФЭЧ, ткани роговицы, почки кролика, амниона человека, куриных диплоидных фибробластах. ВПГ I/II вызывают характерное изменение клеток — набухание, округление, иногда образование синцития. Цитопатический эффект обычно наблюдается через 3 дня, реже через 7 дней. По данным ряда исследователей выявление ВПГ I/II по цитопатическому эффекту достигает 40-50% по истечении суток, 80-82% - через 48 часов, более 90% - через 72 часа [35]. Успех исследования зависит не только от типа индикаторной культуры, но и от вида исследуемого материала и сроков его взятия у больного. При анализе материала, забранного на стадии везикул, вирус удавалось культивировать в 94% случаев, на стадии пустул - в 87%, на стадии язв - в 70%, а на стадии образования корочек - только в 27 % случаев [17,35].

ВПГ I/II культивируются на куриных эмбрионах. Материал вводят в хорион-аллантоисную оболочку. При наличии вируса через 48-72 часа инкубации при 37° С на оболочке образуются очаги поражения в виде бляшек. ВПГ I образует мелкие бляшки — 0,5мм, ВПГ И— более крупные. Кроме этого, ВПГ II вызывает и более тяжелое поражение хорион- аллантоисной мембраны [35].

Для выделения и выращивания ЦМВ используют первично- трипсинизированные культуры клеток фибробластов эмбриона человека, культуры диплоидных клеток человека, Нер-2 [35].

Материалом для детекции ЦМВ служат моча, смывы из зева, соскобы и выделения из урогенитального тракта, слюна, мокрота, кровь, спинномозговая жидкость. Цитопатогенное действие ЦМВ оценивают на зараженной культуре ткани (монослой) в течение 7-30 дней [31,35].

В настоящее время многие исследователи рассматривают культуральный метод как «золотой стандарт» для выявления ВГТГ 1/Н и ЦМВ. Он позволяет обнаружить инфекционный агент, определить его концентрацию. Но метод сложен, продолжителен, имеет высокую стоимость и не позволяет анализировать много образцов, что делает его малопригодным для практических лабораторий.

Методы выявления ВПГ 1/11 и ЦМВ, основанные на детекции вирусных антигенов.

В настоящее время существует несколько вариантов выявления вирусов ВПГ 1/11 и ЦМВ, основанных на иммунологической детекции вирусных антигенов. Широкое практическое применение нашел метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ). Препараты для анализа готовят из тех же субстратов, которые используются для диагностики ВПГ 1/Н и ЦМВ инфекций другими методами. Делают мазки-соскобы, мазки-отпечатки, которые обрабатываются флюоресцирующей специфической сывороткой (поликлональной или моноклональной) с контрастерами. Для увеличения специфичности используют различные разведения сыворотки. На один и тот же препарат можно наносить 2-3 антителсодержащих диагностикума или их разведения. Положительным считается мазок, который содержит не менее 3 морфологически неизмененных клеток с интенсивной флюоресценцией, имеющей типичную локализацию. Для ВПГ 1/Н характерна локализация свечения в ядре и цитоплазме одновременно, для ЦМВ — в ядрышке и ядре [17, 31].При использовании метода непрямой иммунофлюоресценции (НИФ) мазки-соскобы и мазки-отпечатки сначала обрабатываются раствором антител к вирусу, а затем флюоресцинмеченным раствором антивидовых антител. Этим достигается усиление сигнала флюоресценции. Результат считается положительным, если клетки с флюоресцирующими включениями составляют не менее 5% [17, 31].

При исследовании методами ПИФ и НИФ непосредственно клинического материала велик процент ошибок. Это связано с тем, что инфицированных клеток с включениями, как правило, немного и для правильной оценки препарата необходим большой опыт работы. Для устранения этого недостатка рекомендуется на первом этапе провести подращивание исследуемой пробы на культуре клеток. Однако стадия обогащения усложняет метод и снижает его доступность для практиков.

Для выявления вирусных белков-антигенов ВПГ I/II и ЦМВ в клинических образцах разработаны тест-системы, основанные на принципе твердофазного ИФА. Они при 90% специфичности имеют чувствительность - 10³ - 10⁴ бляшкообразующих частиц, что существенно ниже соответствующих показателей ПТДР. Данные системы не нашли широкого применения в практических исследованиях. Исключением являются диагностикумы для выявления фосфопротеина ЦМВ с массой 65000 МД (рр65) [172, 228, 289].

Выявление антител к ВПГ //// и ЦМВ.

Наиболее распространенной технологией выявления антител к ВПГ I/II и ЦМВ является твердофазный ИФА - конкурентный вариант; трехслойный «сэндвич»; четырехслойный «capture» вариант [17, 35]. Созданы тест- системы для выявления антител классов IgG, IgM, суммарных антител.

Наличие достаточно высоких титров IgG и IgM или их рост при анализе парных сывороток, как правило, свидетельствует об острой фазе инфекции или об обострении латентной инфекции. Выявление только антител IgM указывает на первичную острую инфекцию, обнаружение антител 1^0 без ^М — на реконвалесценцию или выздоровление после инфекции [17, 21].

Установлено, что значительная часть человеческой популяции имеет антитела к ВПГ1/П и ЦМВ, следовательно, выявление антител не может быть единственным критерием при постановке диагноза [35]. Титр антител часто не соответствует клинической картине заболевания. Высокие показатели регистрируются и у носителей, и у больных в период обострения. По выявлению антител классов и ^М затруднительно идентифицировать первичную и вторичную инфекции, острую и хроническую стадии заболевания. Возможны ложноотрицательные результаты при определении ^М антител у новорожденных и больных СПИД. При реактивации инфекции антитела и 1§М могут не выявляться [10, 26, 35].

Несоответствие между параметрами иммунного ответа и клиническими проявлениями связана с особенностями инфекций, ассоциированных с ВПГ Т/Н и ЦМВ, часто протекающих на фоне иммунодефицита. В связи с этим информативность выявления антител к герпесвирусам снижается. Это исследование является вспомогательным в общем комплексе методов диагностики ВПГ 1/П и ЦМВ инфекций.

Молекулярно-биологические методы детекции ВПГ 1/П и ЦМВ.

В настоящее время одними из наиболее перспективных методов выявления ВПГ 1/П и ЦМВ являются технологии, базирующиеся на выявлении уникальных фрагментов их нуклеиновых кислот. В 80-е годы 20 века использовался метод ДНК-зондов [17, 49]. Он не нашел широкого применения в практике из-за сложности и недостаточной чувствительности (особенно при использовании нерадиоактивных меток). С 90-х годов началось активное внедрение в диагностику ВПГ 1/П и ЦМВ инфекции метода ПЦР [152].

Первоначально были созданы системы, базирующиеся на классическом варианте ПЦР, одни - для выявления ЦМВ, и другие — для одновременной детекции ВПГ I и ВПГ II без установления типа вируса. К настоящему времени имеются мультиплексные ПЦР системы, позволяющие в одной реакции выявить ВПГ I и ВПГ II и определить тип вируса [318]. Разработаны диагностикумы для одновременной индикации значимых вирусов группы герпеса в различных сочетаниях: ВПГ VIII, ЦМВ, вирус Эпштейн-Барр [165, 282]; ВПГ I, ВПГ II, ЦМВ, Эпштейн-Барр [318, 319]; ВПГ I, ВПГ II, ВПГ III, ЦМВ, вирус Эпштейн-Барр [263].

Чувствительность ПЦР при выявлении вирусов группы герпеса составляет 100 вирионов, что значительно превосходит чувствительность других методов прямого выявления вирусов. При удачном выборе праймеров специфичность приближается к 100%. Продолжительность исследования в зависимости от модификации метода составляет 3-4 часа при применении ПЦР — «real time» и 6-8 часов - традиционной ПЦР. При использовании варианта ПЦР - «real time», возможно определение концентрации вирусов [179, 249].

Сравнение различных современных коммерческих систем ПЦР детекции (ЦМВ, ВПГ I и ВПГ И: «Real time» ПЦР (Abbot), Cobas Amplicor (Roshe), классических вариантов ПЦР с детекцией продукта амплификации ИФА в планшетном формате показало, что аналитические показатели систем близки, порог чувствительности методов в серии разведений составляет 20­45 копий, корреляция результатов 0,94 [307, 389]. Проведены параллельные исследования по выявлению ЦМВ методом «Real Нте»ПЦР и ИФА на рр65- антиген. В ряде работ отмечается высокая корреляция результатов [102, 261, 289], в других - значительное разночтение при высокой эффективности выявления возбудителя каждым из методов [172, 228]. Предпочтение отдается ПЦР из-за более высокой эффективности выявления вируса при низких концентрациях и возможности более ранней (на 14 дней) диагностики CMV-инфекции [102, 289], в то же время показано, что тест на рр65-антиген эффективнее для выявления реактивации вируса [228].

В настоящее время ПЦР - ведущий метод выявления ВПГ I/II и ЦМВ в любых типах клинического материала. Метод активно используется при обследовании доноров и реципиентов при пересадке органов, костного мозга, стволовых клеток [114, 169, 228, 236, 303, 304, 307, 322], для выявления внутриутробного инфицирования и изучения влияния герпесвирусных инфекций на исход беременности [285, 287, 344, 349, 383], определении повреждений ДНК ЦМВ при проведении противовирусной терапии [211].

Бактерии вида С. trachomatis.

Хламидии - мелкие, грамотрицательные бактерии, облигатные внутриклеточные паразиты. У них уникальный цикл развития, в ходе которого они представлены двумя формами - элементарными (ЭТ) и ретикулярными (РТ) тельцами. ЭТ - высокоинфекционные, без метаболической активности овальные клетки размером 250-500 нм. Проникая в цитоплазму клетки хозяина путем пиноцитоза (фагоцитоза), хламидии используют для роста и размножения клеточную АТФ. За 6-8 часов ЭТ превращаются в РТ — метаболически активные размножающиеся структуры. После завершения деления РТ преобразуются в ЭТ и при разрушении клетки хозяина выходят в окружающую среду. Цикл размножения хламидий длится 48-72 часа [15, 18, 25].

С.trachomatis является типичным возбудителем НУГИ, вызывает воспалительные процессы урогенитального тракта у женщин (вульвит, уретрит, кольпит, экзо и эндоцервицит, эндометрит, эндомиометрит, сальпингит, оофорит, цистит, пиелонефрит) и мужчин (уретрит, простатит, везикулит, орхоэпидидимит, фуникулит) [35].

При воспалительных процессах, обусловленных C.trachomatis, у женщин может наблюдаться нарушение физиологического течения беременности, эктопическая беременность, привычная невынашиваемость беременности, бесплодие; у мужчин - нарушение сперматогенеза различной степени выраженности (олигоспермия, астеноспермия, тератоспермия) [35, 139, 353].

Цитологический,метод выявления C.trachomatis. В связи с тем, что размер морфологических структур возбудителя ЭТ колеблется от 200 до 500 нм, а PT достигают 600—1000 нм, они видны в световой микроскоп при увеличении в 900—1350 раз [18, 35]. Мазки-соскобы слизистой урогенитального тракта окрашивают раствором Люголя и по Папаниколау. При этом ЭТ хламидий приобретат розовый, а РТ— синий цвет. Они обнаруживаются в виде скоплений вокруг ядра клетки в форме "шапочки жандарма" или диффузно [18, 42]. Достоверность выявления C.trachomatis при микроскопировании зависит от опыта исследователя. Поэтому, процент обнаружения хламидий по данным разных авторов варьирует от 12% до 40% [18, 25, 35, 38, 64]. Результат зависит также от соблюдения правил отбора материала, кратности исследования, клинической формы и давности заболевания. Цитологический метод широко не применяется из-за субъективности и ненадежности.

Выявление C.trachomatis культивированием. Хламидии, как внутриклеточные паразиты, способны размножаться на клеточных культурах. Обработка клинического материала перед заражением культуры клеток для выявления хламидий, аналогична той, что проводится при детекции вирусов герпеса. В клеточных культурах (ФЭЧ, Heia, СОЦ, диплоидные, клетки L) C.trachomatis вызывают специфические морфологические изменения с образованием большого количества включений, в других (КФ, КЭМ, KB, RES, Нер-2) цитопатический эффект незначителен или выражен в единичных клетках. Установлено также, что различные штаммы хламидий по разному поражают фибробластоподобные или эпителиальные клетки тканевых культур [35].

C.trachomatis инфицируют желточные мешки куриных эмбрионов. Культивирование продолжается 12 суток. Размножение хламидий сопровождается гиперемией кожных покровов и кожными геморрагиями эмбрионов, истончением оболочек желточных мешков и разжижением их содержимого. О наличии C.trachomatis судят также по регулярной специфической гибели эмбрионов. [35, 42]. Культуральные методы выявления C.trachomatis сложны, продолжительны, затратны, что делает их малопригодными для практической диагностики.

Методы выявления C.trachomatis, за счет детекции антигенов. В практике для выявления хламидийного антигена чаще применяют методы ПИФ и НИФ. Подготовка образцов к исследованию и постановка эксперимента сходны с таковыми при ПИФ и НИФ-детекции антигенов ВПГ Т/И и ЦМВ. Для выявления C.trachomatis используют моноклональные антитела к белковому видоспецифичному антигену возбудителя, в качестве флюорофора - ФИТЦ. При микроскопировании определяют хламидийные включения в виде образований с зеленой или желто-зеленой флюоресценцией на коричнево-оранжевом фоне цитоплазмы клеток.

В настоящее время эти простые, быстрые и недорогие методы составляют основу скрининговой диагностики хламидиозов в России. Однако, при работе непосредственно с клиническим материалом, они имеют существенные недостатки — низкая чувствительность и субъективность оценки. При невысоких концентрациях инфекционного агента велика вероятность как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов [18, 35].

Высокой специфичностью и информативностью (возможность выделения чистой культуры и определение антибиотикорезистентности) обладает комбинированый метод, в котором ПИФ проводится после непродолжительного культивирования C.trachomatis на культуре клеток. Многие исследователи считает этот вариант «золотым стандартом» диагностики хламидиоа [18, 35, 38]. Однако усложненный вариант ПИФ малодоступен для практических лабораторий, большинство из которых не располагает оборудованием для работы с клеточными культурами.

Разработаны варианты ИФА для выявления антигенов C.trachomatis [35]. В отличие от ПИФ и НИФ метод ИФА определяет не только бактерии, но и их растворимые антигены, накапливающиеся в жидкостях организма - моче, отделяемом слизистых. К преимуществам ИФА следует отнести быстроту (4-6 часов), высокую пропускную способность и автоматизацию. Метод не нашел широкого применения из-за недостаточной чувствительности при исследовании клинического материала.

Выявление антител, как косвенный метод диагностики хламидиозов. Для выявления антител классов М, О, А к С.Ь'асЬотайв в крови и секретах инфицированного организма используют метод ИФА. При первичном заражении появляются антитела 1§М, затем - и последними -

Угасание иммунного ответа выражено снижением концентрации антител каждого из классов в той же последовательности. При повторном инфицирование быстро нарастают титры антител О и А, антитела класса М практически полностью отсутствуют [18]. При остром хламидиозе обнаруживаются антитела ^М и (или) быстро изменяющиеся количества (нарастающие или снижающиеся) ^О и ^А. Хронический процесс характеризуется стабильными титрами продолжительное время антител классов в и А. Редко (в 3% случаев) при хроническом хламидиозе до появления антител несколько недель регистрируются в низких титрах. Наличие антител класса А в невысоких титрах в течение длительного времени при отсутствии симптомов заболевания свидетельствует о микробной персистенции. Низкие, стабильные во времени титры ^О указывают на давно перенесенную хламидийную инфекцию. Только повторные качественные и количественные исследования на каждый класс антител, проведенные с интервалом в 2-3 недели, дают возможность сделать заключение о характере и стадии заболевания [18].

Непрямые иммунологические методы имеют существенное значение в диагностике хламидиозов. Они позволяют избежать ложноотрицательных результатов, которые могут быть получены прямыми методами при низкой концентрации возбудителя, и в ряде случаев помогают определить стадию и характер течения заболевания. Выявление антител является основным методом диагностики хламидиоза яичников и маточных труб, когда отбор материала для прямого выявления инфекционного агента невозможен или требует хирургического вмешательства [18, 35].

Молекулярно-биологческие методы детекции С. trachomatis. В настоящее время одним из наиболее распространенных методов выявления C.trachomatis является ПЦР. При разработке тест-систем на хламидии в качестве мишени были использованы последовательности хромосомных генов (рибосомальных РНК, главного белка внутренней мембраны) и последовательности мультикопийной видоспецифичной криптической плазмиды [152]. Первые варианты тест-систем потенциально способны взаимодействовать со всеми штаммами C.trachomatis. Вторые варианты имеют чувствительность в 10 раз выше, чем у первых, поскольку в клетке содержится 10 копий плазмиды, однако имеется вероятность ложноотрицательных результатов из-за потери плазмиды. Бесплазмидные штаммы C.trachomatis пока не выявлены, но существование таких культур вероятно.

Для выявления C.trachomatis используются тест системы, базирующиеся на разных типах ПЦР - классической и ПЦР в реальном времени. При сравнительных исследованиях различных вариантов современных тест-систем на хламидии, как правило, показатели их чувствительности и специфичности достаточно близки [208, 210, 376, 377, 380]. Очевидно преимущество диагностикумов, основанных на технологии «Real time» ПЦР по продолжительности исследования. Для анализа 25 проб системой COBAS AMPLICOR («Roche») с выявлением продукта амплификации в планшетном формате потребовалось 232 минуты, при использовании «Real time» ПЦР тест — системы результат был получен через 134 минуты [210]. Достигнуты практически абсолютные показатели аналитической чувствительности - с 95% вероятностью выявляется 1 копия криптической плазмиды и 3 копии гена мембранного белка [209]. Реальная чувствительность составила 10 — 25 копий мишени на пробу [209, 258, 386].

Сравнение ПЦР-детекции C.trachomatis, культурального метода и ИФА выявило преимущество ГТ1ДР в чувствительности и специфичности [113, 159]. При этом культуральный метод превосходил ИФА [159]. Близкие к ПЦР показатели чувствительности и специфичности имел метод обнаружения С.trachomatis флюоресцентно-меченными РНК и ДНК зондами. Совпадение результатов - 89-100% [159, 217]. Не смотря на то, что метод зондов уступал по чувствительности и специфичности ПЦР, он оценен как перспективный для практики [159, 217].

Предложены методы выявления и серотипирования С.trachomatis, сочетающие ПЦР и гибридизацию. Они используются в эпидемиологических исследованиях [381, 396]. На первом этапе амплифицируется фрагмент гена ompl, затем он гибридизуется с зондами, специфичными 15 серотипам С.trachomatis. Результаты, полученные этим методом, совпали с результатами серотипирования секвенированием [396].

Создана мультиплексная «Real time» ПЦР система для детекции C.trachomatis и дифференцировки сероварианта L2, вызывающего венерическую лимфогранулему [188]. Разработаны мультиплексные тест- системы, выявляющие в одной реакции хламидии и другие инфекционные агенты, вызывающие УГИ: C.trachomatis, N.gonorrhoea [123, 258, 376]; C.trachomatis, N.gonorrhoea, U.urealyticum [332]; C.trachomatis, N.gonorrhoea, T. vaginalis [355]; C.trachomatis, ВПГ I/II, T.pallidum [241]. Имеется мультиплексная ПЦР система для детекции патогенных хламидий и хламидофилл: C.trachomatis, C.psittaci, C.pneumoniae, C.peccorum [386]. Она эффективно выявляет как одиночные возбудители, так и их ассоциации. Как правило, конкурентного ингибирования в этих мультиплексных тест- системах не было. Исключение составили системы D.M. Whiley, Т.Р. Sloots [376], для которых отмечено ингибирование при анализе проб, содержащих С trachomatis и N.gonorrhoeae,

Для выявления C.trachomatis используют лигазную цепную реакцию, и транскрипционную амплификации рРНК [385]. Не смотря на ряд преимуществ перед ПЦР, эти методы не нашли широкого применения.

Высокая чувствительность и специфичность, автоматизация ряда стадий, простота и универсальность делает ПЦР перспективным методом диагностики хламидиозов. Он рекомендован и используется для установления инфицирования [108, 210, 222]. Ряд исследователей считают ПЦР «золотым стандартом» выявления C.trachomatis [18].

Диагностика Mollicutes— М. hominis, U. urealyticum.

Mollicutes — мельчайшие (0,5 микрона в диаметре), наиболее просто организованные прокариоты, имеют минимальный набор органелл (мембрану, рибосомы и самую малую бактериальную хромосому, представленную двухцепочечной кольцевой ДНК). В отличие от вирусов они самостоятельно воспроизводятся, а в отличие от большинства бактерий лишены клеточной стенки и не синтезируют ее компоненты. Моликуты - «мембранные паразиты», поскольку они всегда связаны с мембранами, в том числе ядерными [11, 20, 35].

Единого мнения о роли микоплазм и уреаплазм в патологии человека нет. Однако большинство исследователей считают их условно-патогенными микроорганизмами, способными вызывать сложные многофакторные патологические процессы [361]. M.hominis и U.urealyticum часто обнаруживаются у людей с патологией репродукции, с воспалительными процессами урогенитального тракта, и ассоциированы с ними [175, 182, 184, 252, 392]. При инфицировании этими микроорганизмами лабораторных животных и добровольцев установлена возможность развития патологических процессов [276]. Показано, что присутствие M.hominis и U.urealyticum в организме человека изменяет уровни синтеза интерлейкинов [196], способствует развитию аутоиммунных процессов и снижению иммунного статуса [2, 155, 215]. В то же время они часто выявляются у людей без признаков патологии [35, 53, 92].

Кулътуральный метод выявления M.hominis и U.urealyticum. В отличие от C.trachomatis, M.hominis и U.urealyticum способны расти на питательных средах, содержащих 10-20% сыворотки крови животных [11, 35]. Разработаны коммерческие дифференциально-диагностические среды, позволяющие идентифицировать М.ЬогштБ и и.игеа1уйсит по биохимическим свойствам. В их состав наряду с питательной основой и антибитиками входят субстрат, специфичный для ферментов этого микроорганизма и индикатор, реагирующий на изменение рН. При росте искомого микроорганизма изменяется цвет среды [160]. Этот вариант культивирования позволяет определять количество возбудителя, антибиотикорезистентность, не требуется сложное лабораторное оборудование. Этиологически значимый титр уреаплазм и микоплазм - 10⁴ КОЕ/мл и более [11, 35]. Для определения антибиотикоустойчивости образцы с М.Ьошшз и и.игса1у11сит, вносят в питательные среды, с антибиотиками в разных концентрациях. О подавлении роста бактерий судят по отсутствию изменения цвета среды.

Выявление М.1югшт8 и и.игеа1у1;1сит посевом на дифференциально- диагностические среды - один из наиболее распространенных в практике методов. Он прост, информативен, малозатратен. Для получения достоверного результата методом культивирования необходимо соблюдение правил отбора, хранения и транспортировки материала. Образцы помещают в транспортную среду и при температуре 4-6° С быстро доставляют в лабораторию. Оптимальные результаты получаются при проведении посева у постели.

Методы выявления ММотгтБ и и.игесйуйсит за счет детекции антигенов. При работе с клиническим материалом иммунологические методы выявления бактериальных антигенов.М.ЬоггнтБ и и.игеа1у1лсит (ПИФ, НИФ, ИФА) применяются редко из-за низкой чувствительности [11, 35]. Кроме этого, идентификацию затрудняет мимикрия антигенов микоплазм и уреаплазм под клеточные антигены макроорганизма. ПИФ, НИФ, ИФА применяются при идентификации микроорганизмов после культивирования на питательных средах и для определения серотипа и.игеа1уйсит. По результатам серотипирования уреаплазмы были разделены на 2 биотипа: Parvum (серотипы 1,2,6,14) и Т-960 (серотипы 2,4,5,7,8,9,10,11,12,13). Недавно биоварам присвоен статус видов. Серотипы Parvo получили видовое наименование U.parvum, а название U.urealyticum оставлено за серотипами Т-960.

Косвенные методы диагностики микоплазмозов и уреаплазмозов за счет выявления антител M.hominis и U.urealyticum. Для выявления антител классов М, G, А к микоплазмам и уреаплазмам используется метод ИФА [11, 69]. Однако значение этих исследований не столь велико, как в диагностике хламидиозов. Серологические тесты при диагностике инфекций, ассоциированных с M.hominis и U.urealyticum малоэффективны. Отсутствие или низкий титр антител к ним связаны с особенностями их взаимодействия с организмом хозяина. Иммунная система человека часто не определяет эти бактерии как чужеродный агент из-за их сходства с собственными мембранными антигенами. [35].

Дата добавления: 2015-07-20