Разработка ПЦР тест-системы для экспресс-детекции шигелл и энтероинвазивных эшерихий

Бактерии рода Shigella — абсолютные патогены, наиболее вирулентные из представителей семейства Enterobacteriaceae. В связи с этим совершенствование методов выявления этих микроорганизмов является практически важной задачей.

Исследования по созданию ПЦР тест-системы для экспресс-детекции бактерий рода Shigella и энтероинвазивных Е. coli явились логическим продолжением работ по изучению распространения генов факторов патогенности энтеробактерий.

В предыдущих исследованиях было показано, что все свежевыделенные штаммы шигелл в независимости от их видовой принадлежности содержали гены оперона инвазивности и взаимодействовали с праймерами SF1 и SF2, сконструироваными для выявления этотого фактора патогенности.

Для одного из фрагментов, полученных при амплификации тотальной ДНК клинического изолята S.flexneri 2а на базе НИИ биоорганической химии им. Ю.А. Овчинникова и М.М. Шемякина РАН (Москва)^ была определена полная первичная структура. Фрагмент имел следующую последовательность нуклеотидов:

GTTTTTAATACTCCTGAACGGCGTTTTTTTTAGATTGGCTCCATTAT

TTTTCTTTCTTCCATTTTTAAATAACGGTATAATTTCTCCATCTATTA

GAATACCTGTGATTTTTCTTGTTGCATCAGGATTAATTACTTCTGGT

AAGGTAGACATAGGTTCTTCTGTTTTTGAACATGTTTATTTCCTTAT

GTTCAAGGAAATAATTGTTGGCCTCCTTCTCTCTTTTTGCTTGTCTC

TTCCCTTTTGGATATTTCATGCTGTTGGTAGCATTATTGACAACCAG

CGTGGGGCAACGCTTAGTAGTTCAATTGATCCTGCCAATGGTGTTG

ATACGTCTGAGTTGGCAAAATTTTTCAATCTTTTTTCTGCAGTTGTA

TTTCTATACAGTGGTGGTATGGTCTTTATTTTAGAATCCATACAATT

GTCTTATAATATATGCCCGTTATTTTCTCAATGTTCTTTCCGTGTCT

CAAATATCTTAACATTTCTGACTTTATTGGCAAGTCAGGCTGTTATT

TTAGCCAGTCCTGTTATGATAGTATTGTTACTATCAGAAGTATTACT

TGGTGTATTATCGAGATTTGCTCCGCAGATGAATGCTTTTTCCGTA

TCATTAACTATTAAAAGTTTACTTGCAATATTTATTATTTTCATCTG

TTCTTCTACTATTTACTTTTCTAAAGTTCAATTTTTCCTCGGTGAAC

ATAAATTTTTCACAAATCTATTTGTTAGATAAAATATTATGGCAAAT AAAACAGAAAAGCCGACACCTAAAA

На основании компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей базы данных «DNA-star» показана 100%-ная гомология данного фрагмента с участком оперона инвазивности размером 776 п.н., расположенного на плазмиде pMYSH6000 штамма S. flexneri 2а YSH6000 (База данных «DNA-star»), Полное совпадение нуклеотидной последовательности фрагмента, клонированного нами, и ранее описанного фрагмента, свидетельствовало о высокой консервативности этого участка оперона инвазивности и о его перспективности в качестве мишени при детекции бактерий рода Shigella.

Дополнительно специфичность праймеров была исследована на коллекции чистых культур энтеробактерий: S. dysenteriael (2 шт), S. flexneri (20 шт), S. sonnei (14 шт), S. boydii (15 шт), Е. coli серовариантов 08, 026, Ol44, 0124, 086 (всего 30 шт.), Salmonella ssp. (10 шт.), Klebsiella ssp. (12 шт.), Enterobacter ssp. (10 шт.) и др. Все свежевыделенные штаммы бактерий рода Shigella дали положительный результат при применении метода ПЦР, большинство музейных культур шигелл взаимодействовали с праймерами. Положительные результаты были получены также для 3-х штаммов E.coli сероварианта 0124. Часть штаммов шигелл, хранящихся в музее более года, дали отрицательный результат. При проведении плазмидного анализа этих штаммов была выявлена элиминация крупных плазмид (140мД и 120 мД), содержащих по данным литературы оперон инвазивности [321].

При выявлении шигелл и энтероинвазивных эшерихий в клиническом материале с помощью первого варианта ПЦР тест-системы эффективность амплификации была достаточно низкой, что сказывалось на чувствительности и качестве электрофореграммы (слабое свечение специфических фрагментов, шлейфы продуктов неспецифического синтеза).

Качественный результат ПЦР был получен после обогащения исследуемых проб инкубацией в селенитовом бульоне в течение 18 часов.

Введение стадии культивирования увеличивало продолжительность исследования. Для повышения качества теста необходимо было увеличить чувствительность и повысить технологичность метода. Традиционные варианты ПЦР с высокой чувствительностью (ПЦР с гибридизационной детекцией продукта амплификации и «гнездовая» ПЦР) не могли быть нами использованы иза их сложности и продолжительности.

Дальнейшее совершенствование тест-системы для детекции бактерий рода Shigella проводилось совместно с лабораторией молекулярно- биологической диагностики ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.

Для увеличения чувствительности и специфичности был применен вариант «буст»-ПЦР. В этом варианте, как и в «гнездовой» ПЦР, используется две пары праймеров, но амплификация проводится в одной реакционной смеси.

Это достигается благодаря особому температурному режиму процесса. Первые 10 циклов амплификации проводят при высокой температуре отжига праймеров, за счет этого синтез идет с пары более длинных высокоспецифичных «внешних» праймеров. После 10-ти циклов температура отжига снижается, и амплификация в завершающих 30 циклах продолжается со второй пары более коротких по размеру «внутренних» праймеров. При этом в качестве матрицы для синтеза выступают в основном фрагменты ДНК, синтезировавшиеся на первом этапе с «внешних» праймеров, а не исходная ДНК-мишень.

«Буст» ПЦР позволяет отказаться от детекции продукта амплификации зондом, поскольку за счет длинных праймеров достигается высокая специфичность на стадии инициации синтеза. Второй этап (синтез с коротких праймеров при относительно мягких условиях отжига) позволяет повысить эффективность амплификации и получить большое количество ДНК, которое возможно выявить электрофорезом в агарозном геле. Этот вариант проще в исполнении, дешевле и занимает меньше времени, чем «гнездовая» ПЦР или ПЦР, сопряженная с гибридизацией. Проведение реакции в один этап, в одной реакционной смеси, уменьшает вероятность контаминации.

Компьютерный подбор и синтез праймеров выполнялся в лаборатории молекулярной диагностики ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, проверка специфичности праймеров на чистых культурах энтеробактерий, апробация тест-системы на клиническом материале проводилась на базе ННИИЭМ. В результате совместной работы для системы были отобраны следующие 2 пары праймеров:

«внешние». вЫ 5'- ССТАСТТСТТТСТССАТССТАТСОТСАСС-З';

8112 5' - СТААССАТТОССССАСССТССТТСТС-З'; «внутренние»: вЪЗ 5' - ССАСАТТТТСААССТСЖТТС-З';

ЭЬ4 5' - СвССААСААТТАТТТССТТС-З'.

При работе с новым вариантом тест-системы для подготовки проб к ПЦР использовали набор реактивов «ДНК-сорб Б» (производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора), основанный на лизисе материала детергентом, с последующей сорбцией ДНК на селикагеле.

Тест-система комплектовалась стандартным реакционным буфером, Taq-пoлимepaзoй, праймерами произведенными и проконтролированными во ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. Амплификацию проводили на наиболее совершенной модели отечественного термоциклера «Терцик МС-2» фирмы «ДНК-технология» (г. Москва).

Повышение качества выделения ДНК, использование более совершенной модели термоциклера и стандартизованных, качественных реактивов увеличило эффективность амплификации. Это позволило и при одноэтапной ПЦР синтезировать достаточное количество фрагмента ДНК, детектируемое методом электрофореза. Поскольку данный вариант ПЦР менее затратен и занимает меньше времени, чем «буст» ПЦР в дальнейших исследованиях использовали одностадийную ПЦР с внешних праймеров.

Новая тест-система, получившая наименование «Amply-Inv», позволила оптимизировать, упростить детекцию шигелл и энтероинвазивных эшерихий и повысить ее качество, что было продемонстрировано при лабораторных испытаниях.

Испытания системы проводили в соответствии с требованиями, предъявляемыми ФГУН ГИСК им. JI.A. Тарасевича Роспотребнадзора. На момент разработки диагностикума мы не смогли найти коммерческих аналогов для проведения сравнительных испытаний, поэтому сравнивали экспериментальную тест-систему с вариантом ПЦР-детекции шигелл и энтероинвазивных эшерихий, предложенным в практическом руководстве "Diagnostic Molecular Microbiology, Principles and application" [152].

Определяли предел измерения (аналитическая чувствительность), чувствительность, специфичность, ценность положительных результатов, ценность отрицательных результатов. Для сравнительных исследований использовали чистые культуры бактерий рода Shigella и фекальные пробы от больных ОКИ.

1) Выделение ДНК для ПЦР-исследования проводили набором реактивов «ДНК-сорб Б».

2) ПЦР с использованием экспериментальной тест-системы «Amply-Inv» осуществляли согласно методике, изложенной в разделе «Материалы и методы» данной работы.

3) ПЦР с применением «контрольной» системы выполняли по инструкции, изложенной в руководстве. Был изменен только метод выявления продукта амплификации. Вместо гибридизации по Саузерну использовали электрофорез в агарозном геле.

В качестве контрольных образцов были использованы препараты ДНК штаммов из рабочей коллекции лаборатории молекулярно-генетических методов надзора за инфекционными заболеваниями ННИИЭМ. -отрицательный контрольный образец (К-) — водный раствор тотальной ДНК

S. typhimurium №1433;

-положительный контрольный образец (К+) - водный раствор тотальной ДНК S.flexneri 2а №38.

Отрицательный контроль. Результаты анализа считали достоверными, если при анализе электрофореграммы в отрицательном контроле отсутствовал фрагмент ДНК размером 760 п. н - специфичный ампликон для тест-системы «Ampli Inv» и фрагмент 348 п.н. - специфичный ампликон для «контрольного» варианта ПЦР.

Положительный контроль. Результаты анализа считали достоверными, если при анализе электрофореграммы в положительном контроле при использовании системы «Amply-Inv» присутствует фрагмент размером 760 п.н. Для «контрольного» варианта ПЦР результаты анализа считали достоверными, если в положительном контроле выявлялся фрагмент размером 348 п.н. Сравнение аналитической чувствительности тест-систем проводили с использованием десятикратных разведений культуры S.flexneri 2а №38. 18-часовую бульонную культуру разводили стерильным физиологическим раствором в 10, 100, 1000, 10000 и 100000 раз. Количество микроорганизмов в разведениях оценивали по количеству колоний, выросших на чашке с МПА после высева по 0.1 мл из каждого разведения.

Тест-система «АмрН Inv» в 100% случаев выявляла Shigella.2a №38 при концентраци клеток в пробе 5x10" кл/мл. Аналитическая чувствительность «контрольной» системы была ниже - 5x10³ кл/мл (табл.3.).

Проведено сравнение аналитической чувствительности тест-систем при анализе препаратов нуклеиновых кислот. Концентрацию препарата тотальной ДНК S.flexneri 2а №38 измеряли на спектрофотометре СФ-26 в соответствии с методом, предложенным в руководстве Т.Маниатиса с соавторами [46]_?и готовили разведения ДНК от 10"⁸ г/мл до 10"¹¹ г/мл (табл.4.).

Таблица 3.

Аналитическая чувствительность тест-систем (минимально выявляемое количество клеток 8.Аехпеп 2а №38 в 1 мл.)

Концентрация	Число	Положительные результаты
бакт.клеток	постановок
(кл/мл)	ПЦР	«АмрН-Inv»	«Контрольная»
5x10^7
5x10^6
5х10^5
5x10^4
5x10"
5x10^2

Таблица 4

Аналитическая чувствительность тест-систем (минимальное выявляемое количество ДНК Shigella flexneri 2а №38 в 1 мл)

Концентрация ДНК (г/мл)	Число постановок ПЦР	ножительные результаты
«АмрН-Inv»	контрольная»
Ю^-8
10"^у
10~'°
10-"

Тест-система «Ашр1у-1пу» стабильно выявляла ДНК Б.Пехпеп 2а №38 в концентрации 10"¹¹ г/мл, а "контрольная" система - в концентрации ДНК КЗ"¹⁰ г/мл.

Проведено сравнение тест-системы «Ашр1у-1пу» и «контрольной» тест- системы при анализе образцов клинического материала. Исследовано 38 ректальных проб от пациентов с диагнозом дизентерия (в 92% подтвержденном бактериологическим исследованием) и 44 ректальные пробы от больных с желудочно-кишечными заболеванииями неинфекционной природы (энтерит). Бактериальные возбудители ОКИ в них не выявлены. Результаты исследования представлены в таблице 5.

Таблица 5.

Сравнение тест-систем «Атр1у-1пу» и «контрольной» системы по результатам исследования образцов клинического материала.

Результаты исследования тест-системой	Пробы от больных с диагнозом	Чувствительность[1]	Специифичность[2] *	Ожидаемая ценность***
дизент ерия	энтерит	полож. рез-та	отриц. рез-та
АмрН 1пу
положительн.			97,3 ±2,6%	95,4 ±3,2%	94,8 ±3,3%	97,6 ±2,3%
отрицательн.
Контрольная
положительн.			94,7 ±3,6%	95,4 ±3,2%	94,7 ±3,4%	95,4 ±3,2%
отрицательн.

дизентерия к общему количеству проб от этих пациентов. Показатель чувствительности составил:

-для тест-системы «Amply-Inv» - 37/38 х 100 % = 97,3 % для «контрольной» системы - 36/38 х 100% = 94,7%

**Специфичность определяли как процентное отношение количества отрицательных результатов в группе пациентов с желудочно-кишечными заболеваниями неинфекционной природы к общему количеству проб от этих пациентов. Показатель специфичности составил для обеих тест-систем: 42/44 х 100 % = 95,4 %

* * * Ожидаемую ценность положительного результата определяли как процентное отношение количества положительных результатов в группе больных с диагнозом дизентерия к общему количеству положительных проб в обеих группах обследованных. Показатель составил:

-для тест-системы «Amply-Inv» - 37/39 х 100 % = 94,8 % -для «контрольной» системы - 36/38 х 100% = 94,7%

Ожидаемую ценность отрицательного результата определяли как процентное отношение числа отрицательных результатов в группе больных с желудочно-кишечными заболеваниями неинфекционной природы к общему числу отрицательных результатов в обеих группах. Показатель составил:

-для тест-системы «Amply-Inv» - 42/43 х 100 % = 97,6 % -для «контрольной» системы - 42/44 х 100% = 95,4%

При ПЦР-исследовании искусственно контаминированных образцов продуктов питания чувствительность тест-систем составляла от 500 до 1000 клеток на 1г или 1мл пробы.

Сравнительные исследования продемонстрировали, что ПЦР тест- система «Amply-Inv» для выявления ДНК бактерий рода Shigella и энтероинвазивных Escherichia практически по всем определяемым параметрам превосходила «контрольную» тест-систему.

Показатели аналитической чувствительности, практической

чувствительности и специфичности свидетельствуют о том, что тест-система «Amply-Inv» соответствует требованиям, предъявляемым к дииагностическим препаратам подобного класса, и может использоваться в практике здравоохранения для экспресс-детекции шигелл и энтероинвазивных эшерихий. Это было подтверждено при проведении испытаний диагностикума (раздел 2.2.2.2. Использование ПЦР тест-систем для детекции бактерий родов Shigella и Salmonella в санитарно- эпидемиологической и клинической практике).

Параллельно с практическим применением продолжались работы по совершенствованию тест-системы. С 2003 года она комплектуется внутренним контрольным образцом (ВКО), который позволяет выявлять случаи ингибирования ПЦР и тем самым избегать ложноотрицательных результатов. С целью предотвращения контаминации продуктами амплификации и получения ложноположительных результатов тест-система комплектуется системой антиконтаминационной модификации ампликонов На рисунке 1 представлена электрофореграмма ампликонов, полученных с использованием современного варианта тест-системы для детекции шигелл.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16 17 18 Рис. 1. Электрофореграмма продуктов ПЦР. Пример использования тест-системы для выявления бактерий рода Shigella, имеющих ВКО, трек 18 - К+;

треки 8, 13 - положительные пробы, остальные треки - отрицательные пробы, 2.2.1.5. Адаптация отечественных ПЦР тест-систем для выявления бактерий рода Salmonella к практическим исследованиям.

Бактерии рода Salmonella являются одними из наиболее распространенных, социально и экономически значимых возбудителей ОКИ. Разработка технологий для экспресс-детекции сальмонелл является актуальной проблемой. Предложенные ранее методы, основанные на выявлении антигенов сальмонелл, не нашли широкого применения в практической диагностике. В связи с тем, что антигенные детерминанты сальмонелл сходны с аналогичными структурами Е. coli, Citrobacter и ряда других энтеробактерий [89], что приводит к перекрестным реакциям и получению ложноположительных результатов.

В этом разделе работы мы изучали возможность использования отечественных экспериментальных ПЦР тест-систем для экспресс-детекции сальмонелл в смывах с объектов внешней среды, в продуктах питания и клиническом материале.

Первая в Российской Федерации ПЦР тест-система для выявления бактерий рода Salmonella была разработана в фирмой «Ниармедик» в 1994г. Праймеры диагностикума позволяют амплифицировать консервативный участок ДНК арабинозного оперона АгаС сальмонелл.

Согласно инструкции по применению, полученной от разработчиков, тест-система предназначалась для ПЦР-детекции S.typhimurium. Создание тест-системы с такой высокой специфичностью представлялось нам мало вероятным, поскольку различные сероварианты сальмонелл являются генетически близкими формами. В связи с этим, на первом этапе работы была проведена оценка специфичности тест-системы на коллекции чистых культур энтеробактерий. Результаты проверки представлены в таблице 6.

Для всех серовариантов сальмонелл, использованных в качестве тестерных, был получен положительный результат. Праймеры тест-системы не взаимодействовали с микроорганизмами других родов энтеробактерий, включая такие антигенно близкие формы как Citrobacter freutidii 021, 022, 038; Е. coli 0111,044, Oll.

Тест-система наряду с S.typhimurium позволяет выявлять другие сероварианты сальмонелл. Это свидетельствует о ее специфичности на уровне рода, а не на уровне отдельного сероварианта.

Таблица 6

Проверка специфичности ПЦР тест-системы для экспресс-детекции сальмонелл на чистых культурах энтеробактерий

Микроорганизм	Результат ПЦР
Salmonella typhimurium В	положительный
Salmonella enteritidis D1	положительный
Salmonella haifa В	положительный
Salmonella kottbus C2	положительный
Salmonella infantis Q	положительный
Salmonella senftenberg E4	положительный
Citrobacter freundii 021	отрицательный
Citrobacter freundii 022	отрицательный
Citrobacter freundii ОЗ8	отрицательный
Klebsiella pneumoniae	отрицательный
E. coli Ol 11	отрицательный
E. coli Oll	отрицательный
E. coli 044	отрицательный

Для определения аналитической чувствительности тест-системы были выбраны штаммы доминирующих серовариантов Б^урЫтигшт и 8.еп1егШё1з. В экспериментах с десятикратными разведениями культур

тестерных штаммов для каждого из них была установлена аналитическая

"3

чувствительность 10 кл/мл.

При постановке ПЦР согласно инструкции к тест-системе наблюдался неспецифический синтез. Кроме этого, предложенная авторами программа амплификации сложная и громоздкая, включает пять стадий.

горячий старт	93°С 10 мин	1 цикл
денатурация ДНК	93°С 1 мин. 60°С 1 мин. 72°С 1,5 мин.	5 циклов
отжиг праймеров
синтез фрагмента
денатурация ДНК	93°С 1 мин. 57°С 1 мин. 72°С 2 мин.	5 циклов
отжиг праймеров
синтез фрагмента
денатурация ДНК	93°С 1 мин. 55°С 1 мин. 72°С 3 мин.	25 циклов
отжиг праймеров
синтез фрагмента
денатурация ДНК	93°С 1 мин 55°С 4 мин. 72°С 7 мин.	1 цикл
отжиг праймеров
синтез фрагмента

На этапе адаптации тест-системы на основании результатов экспериментов с культурами бактерий и контаминированными субстратами были внесены изменения в состав реакционной смеси: на 25% уменьшено количество праймеров - с 4 до 3 мкл (по 1,5 мкл каждого) на одно исследование, объем вносимой бидистиллированной воды соответственно увеличился с 4 до 5 мкл. Изменена программа амплификации: горячий старт сократили до 4-х минут, процесс проводили при одной температуре отжига праймеров: 57° С, температуру денатурации повысили до 94° С После адаптации исследование проводили по следующей программе:

горячий старт	94°С 4 мин.	1 цикл
денатурация ДНК	94°С 1 мин. 57°С 1 мин. 72°С 1 мин.	35 циклов
отжиг праймеров
синтез фрагмента

Оптимизация программы и состава реакционной смеси позволила сократить продолжительность исследования и получить более качественные электрофореграммы продуктов амплификации.

При проведении исследований клинического материала, смывов с объектов внешней среды, продуктов питания был выявлен ряд недостатков данного диагностикума. Для стабильной работы тест-системы было необходимо подращивание исследуемого материала в накопительной хлор- магниевой среде, что приводило к усложнению исследования и увеличению его продолжительности.

Вторая тест-система для детекции бактерий рода Salmonella, «Ампли- сенс - Salmonella species 250» разработки ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, апробированная нами, является диагностикумом следующего поколения. Она, как и другие системы серии «Ампли-сенс», представляет комплект из двух реакционных смесей. Праймеры, входящие в состав тест-системы, позволяют амплифицировать фрагмент гена белка фимбрий сальмонелл размером 225 п.н.

В таблице 7 представлены результаты сравнения тест-системы «Ампли- сенс - Salmonella species 250» и тест-системы для детекции сальмонелл разработки фирмы «Ниармедик» Москва.

Таблица 7

Сравнительная характеристика отечественных экспериментальных ПЦР тест- систем для экспресс-детекции бактерий рода Salmonella первого и втрого поколений

Тест-система	Комплек тация	Длительн. анализа	Чувствитель ность кл/мл	Специфич ность	Подращи вание
Тест-система фирмы «Ниармедик»	Все реактивы отдельно	26 часов		95%	Требует ся
Тест-смстема «Амплисенс- Salmonella species 250»	Реактивы в составе 2-х реакц. смесей	6-8 часов		95%	Не требу ется

Проведенные исследования выявили преимущества экспериментальной ПЦР тест-системы «Ампли-сенс-Salmonella species 250» разработки ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. По своим рабочим характеристикам она наиболее полно соответствует требованиям практической медицины. Чувствительность новой системы в 2 раза выше. Применение на стадии подготовки проб сорбционной технологии и более удобное комплектование реактивов делает тест-систему ЦНИИЭ более технологичной и простой в работе. Отсутствие стадии подращивания исследуемых проб сокращает продолжительность исследования.

Все дальнейшие исследования проводились нами с использованием тест-системы «Ампли-сенс-Salmonella species 250».

Дата добавления: 2015-07-20