Использование ПЦР тест-систем для детекции бактерий родов Shigella и Salmonella в санитарно-эпидемиологической и клинической практике.

Как правило, практическое применение ПЦР тест-систем для выявления бактерий родов Shigella и Salmonella проходило параллельно с лабораторными исследованиями, посвященными их совершенствованию. ПЦР-диагностика шигеллезое. Первый экспериментальный вариант тест- системы на шигеллы был апробирован при расследовании случаев групповой заболеваемости дизентерией в соматических стационарах г. Нижнего Новгорода.

Так в городской психиатрической больнице №1 были зарегистрированы повторяющиеся вспышки дизентерии, вызванной штаммом Shigella flexneri 2а. Было сделано предположение о бактерионосительстве среди пациентов и сотрудников больницы. Микробиологические исследования не выявили бактерионосителей. Для дальнейшей проверки предположения о бактерионосительстве было проведено обследование сотрудников и пациентов, имеющих антитела к шигеллам, методом ПЦР с использованием «in hause» тест-системы, основанной на праймерах SF1 и SF2. Исследовали пробы фекалий 40 человек. У 2 больных и 5 технических сотрудников были выявлены бактерии рода Shigella. На рисунке представлена электрофореграмма продуктов ПЦР, полученных при исследовании проб от серопозитивных пациентов больницы. После дополнительного курса лечения, повторное ПЦР обследование установило элиминацию возбудителя. В дальнейшем вспышки дизентерии в этом стационаре не регистрировались (рис. 7).

Экспериментальная лабораторная ПЦР тест-система на бактерии рода Shigella апробировалась также при расшифровке вспышек ОКИ в Доме ребенка Автозаводского района г. Нижнего Новгорода. В течение короткиого промежутка времени были зарегистрированы два групповых заболевания, по клиническим признакам сходных с дизентерией. Однако выявить шигеллы у больных традиционным бактериологическим методом не удавалось.

1 23456789 10 11 Рис. 7. ПЦР-исследование клинических проб серопозитивных пациентов с применением тест-системы первого поколения для экспресс-детекции шигелл и энтероинвазивных эшерихий

треки 3 и 10 положительный сигнал; трек 4 - слабо-положительный сигнал).

Методом ПЦР во время первой вспышки было проведено обследование 15 детей, возбудители дизентерии были выявлены у 3 человек. Во время второй вспышки при обследовании 10 детей с подозрением на дизентерию, у 3 пациентов методом ПЦР также были выявлены шигеллы.

При купировании вспышки дизентерии в психиатрической больнице и расшифровке вспышек ОКИ в доме ребенка, несмотря на отрицательный результат микробиологических исследований, метод ПНР позволил в первом случае установить источник инфекции, а во втором — этиологический агент. Однако недостатком проведенных ПЦР-исследований была их продолжительность. Результаты, из-за необходимости подращивания проб, были получены на 3-4 сутки, что не соответствует требованиям, предъявляемым к экспресс-методам.

Последующие, исследования проводились с использованием тест- системы «Ашр1у-1пу». Ее апробация была проведена на базе детской инфекционной больницы №8 г. Н. Новгорода. Было исследовано 165 фекальных проб от больных с диагнозами: ОКИ, дизентерия, гастроэнтерит, энтерит, пищевая токсикоинфекция, ОРВИ. Работа проводилась в режиме сопровождения лечебного процесса. Все пробы параллельно исследовались микробиологическим методом в бактериологической лаборатории больницы №8. Полученные результаты представлены в таблице 11.

Таблица 11.

Частота выявление бактерий рода Shigella у больных различными нозологическими формами заболеваний желудочно-кишечного тракта методом ПЦР и бактериологическим методом

Диагноз	Кол-во пациентов	Выявлено шигелл
ПЦР	Бактер. метод
Абс.ч.	%	Абс.ч.	%
ОКИ			61,2±6,9		16,3±5,3
Дизентерия			94,4±5,4		55,5±11,7
Гастроэнтерит		—	—	—	—
Энтерит		—	—	—	—
ОРВИ		—	—	—	—
Пищ.токс.инфекция		—	—	—	—
Всего			28,5±3,5		10,9±2,4

При ПЦР-исследовании шигеллы были выявлены у 47 пациентов (28,5±3,5%), при бактериологическом анализе шигеллы выделены из 18 образцов (10,9±2,4%). Эффективность выявления шигелл методом ПЦР во всей выборке оказалась достоверно выше бактериологического анализа в 2,6 раза (г = 4,2).

Положительные результаты, полученные обоими методами, были зарегистрированы при обследовании детей с диагнозами «ОКИ» и «дизентерия». Клинический диагноз «дизентерия» был подтвержден методом ПЦР у 17 пациентов из 18, бактериологическим методом - только у 10. При диагнозе ОКИ шигеллы выявлены ПЦР в 61,2±6,9% случаев, а высеяны только в 16,3±5,3 %. Эффективность ПЦР диагностики по сравнению с микробиологическим исследованием выше в 3,8 раза.

При одновременном исследовании клинического материала методом ПЦР и бактериологическим было получено 4 варианта результатов (рис. 8).

Данные бактериологического анализа и ПЦР-исследования совпадали в 80,0±3,1% случаев: отмечено совпадение отрицательных результатов — в 70,4±3,6%; а положительных результатов - в 9,6±2,3%.

Наиболее распространенный вариант несовпадения - положительный результат в ПЦР и отрицательный в микробиологическом исследовании был выявлен в 18,8±3,0% случаев. Существование таких вариантов может быть объяснено тем, что метод ПЦР как более чувствительный позволяет обнаружить низкие концентрации возбудителя, которые бактериологическим методом не определяются. Кроме того, метод ПЦР выявляет бактерии, находящиеся в некультивируемом состоянии.

■ ПЦР- БАК -

■ ПЦР + БАК +

■ ПЦР + БАК -

■ ПЦР - БАК +

Рис.8. Варианты результатов, полученные при параллельном исследовании клинического материала на наличие шигелл ПЦР и бактериологическим методом (в %).

Такая форма состояния сравнительно недавно выявлена у энтеробактерий - сальмонелл, шигелл и ряда других [23, 71]. Некультивируемое состояние характеризуется снижением метаболической активности и неспособностью рости на питательных средах при полном сохранении генома.

В 2 пробах шигеллы были выявлены бактериологически при отрицательном результате в ПЦР. Это, возможно, связано с ингибированием ПЦР компонентами клинической пробы. На момент проведения исследований тест-система еще не комплектовалась внутренним контрольным образцом, позволяющим выявлять случаи ингибирования ПЦР.

Следует отметить, что у детей со стертой клинической формой ОКЗ или с отсутствием симптомов заболевания результат бактериологического анализа, как правило, был отрицательным, а методом ПЦР шигеллы выявлялись.

1%

Высокая чувствительность метода ПЦР позволяет выявлять низкие концентрации возбудителя, которые не вызывают манифестных форм заболевания. Полученный результат согласуется с исследованиями,
проведенными в Бангладеш [204], в которых показано преимущество метода ПЦР при детекции шигелл в клиническом материале.

Достоинства тест-системы «Amply-Inv» были продемонстрированы и подтверждены при расшифровке крупной вспышки дизентерии, охватившей 300 человек, в г. Кстово Нижегородской области осенью 2005г.

При поиске источников и факторов передачи инфекции исследовались фекальные пробы сотрудников молокоперерабатывающего предприятия, пробы питьевой воды, образцы продукции местного молочного комбината. Бактериологические исследования проб воды, смывов с оборудования на разных этапах технологического процесса, образцов продукции комбината не выявили шигелл.

Несколькими днями позднее были взяты аналогичные пробы и исследованы нами методом ПЦР на наличие бактерий рода Shigella. Полученные результаты представлены в таблице 12.

Таблица 12

Результаты ПЦР исследования различных материалов на наличие бактерий рода Shigella.

Анализируемый материал	Количество образцов
Исследованных	Положительных
Пробы воды
Продукты питания		1*
Смывы с объектов внешней среды
Фекальные пробы		2**

* - проба масла Кстовского молочного комбината;

** - пробы фекалий рабочих Кстовского молочного комбината

В результате бактерии рода Shigella были выявлены в одной из проб масла Кстовского молочного комбината и в фекальных пробах двух сотрудниц этого предприятия. Следует отметить, что в крови этих же сотрудниц методом РНГА службой санэпиднадзора были обнаружены антитела к шигеллам в диагностически значимом титре 1:200. Результаты ПЦР и серологического исследования, анализ особенностей распространения заболевания и санитарного состояния комбината в значительной степени подтверждали причастность к вспышке дизентерии Кстовского молочного комбината.

Тест-система «Amply-Inv» была апробирована также при расследовании вспышки ОКИ в детском оздоровительном лагере в Городецком районе в летний период 2002 г. Было обследовано 10 детей, госпитализированных из лагеря с диагнозом «ОКЗ». Во всех фекальных пробах этих детей методом ПЦР были выявлены бактерии рода Shigella, бактериологический анализ выявил наличие шигелл только у 3 детей.

Таким образом, использование ПЦР тест-системы «Amply-Inv» значительно (в 2,6 - 3,8 раза) позволяет повысить эффективность выявления шигелл при первичной диагностике ОКИ. Особо следует отметить положительные результаты детекции возбудителя при стертом и бессимптомном течении заболевания. Полученные результаты свидетельствуют не только о перспективности использования системы в лабораторной диагностике шигеллезов, но и о целесообразности ее использования при расшифровке вспышек дизентерии (для обследования контактных лиц, анализа объектов внешней среды, продуктов питания) с целью выявления источников и факторов передачи инфекции. Опыт практического применения тест-системы «Amply-Inv» свидетельствует о возможности ее успешного использования бактериологическими лабораториями инфекционных стационаров и ФГУЗ Центров «Гигиена и эпидемиология» Роспотребнадзора, располагающими оборудованием для проведения ПЦР.

ПЦР-диагиостика сальмонеллезое. ПЦР тест-система для выявления бактерий рода Salmonella разработки фирмы «Ниармедик» (Москва) апробирована при проведении плановых санитарно-эпидемиологических мероприятий весной 1995 г. Нами совместно с сотрудниками центра ГСЭН г. Н. Новгорода были обследованы мясокомбинат №1, продуктовые рынки Ленинского и Сормовского районов г. Н. Новгорода. Производились смывы с с тушек кур, мяса, яиц, оборудования, торгового инвентаря, прилавков. Пробы отбирали одновременно для ПЦР-исследования и бактериологического анализа. Микробиологические исследования на наличие бактерий рода Salmonella проводили специалисты бактериологической лаборатории городского центра ГСЭН.

Проанализировано 78 образцов. В 24 (30,8±5,2%) из них методом ПЦР были выявлены сальмонеллы, микробиологическим методом они были выделены из 10 (12,8±3,8%) смывов. Сальмонеллы методом ПЦР выявлялись в 2,4 раза достоверно чаще (t=2,8). Следует отметить, что все пробы, давшие положительный результат при бактериологическом исследовании, оказались положительными и при ПЦР-детекции.

Эта ПЦР тест-система была использована для выяснения причин повторяющихся внутрибольничных вспышек сальмонеллеза в больнице №35 г. Нижнего Новгорода в 1998 году. При проведении эпидемиологического расследования вспышек городской службой СЭН в результате серологического скрининга персонала больницы № 35 были выявлены 2 сотрудника (работники пищеблока) с серопозитивной реакцией. Бактериологический анализ положительных результатов не дал. При проведении ПЦР-исследования проб фекалий этих сотрудников на бактерии рода Salmonella в обоих случаях были получены положительные результаты, что свидетельствовало о бессимптомном носительстве. После санации бактерионосителей вспышки сальмонеллеза в больнице №35 не повторялись.

Апробированная тест-система показала свою эффективность при проведении санитарно-эпидемиологических исследований. Тем не менее, ряд ее недостатков, в первую очередь, необходимость культивирования исследуемых проб в накопительной среде, не позволяет рекомендовать ее для экспрессного выявления сальмонелл.

Дальнейшие исследования проводили с использованием тест-системы следующего поколения «Ампли-сенс - Salmonella species 250». За период 1999-2000гг. тест-система апробировалась при расследовании двух вспышек сальмонеллеза и при плановых обследованиях продовольственных рынков г. Нижнего Новгорода.

В июне 1999 года была зарегистрирована вспышка сальмонеллеза в Городецком районе Нижегородской области, охватившая 100 человек. Все заболевшие отмечали употребление пирожных с кремом, при приготовлении которого использовались яйца Балахнинской птицефабрики. В связи с этим была проведена проверка санитарного режима на указанном объекте. Исследования проводились совместно с сотрудниками бактериологической лаборатории и эпидотдела Областного центра ГСЭН и эпидемиологического отдела центра ГСЭН г. Балахны. Были исследованы 34 смыва с оборудования убойного и других цехах на разных этапах технологического процесса, с тушек птиц, с яиц, спецодежды, рук персонала, складского оборудования.

Несмотря на то, что непосредственно перед проверкой на фабрике проводились дезинфекционные мероприятия, на всех этапах технологического процесса была выявлена высокая контаминация оборудования сальмонеллами. Положительные находки были даже в пробах клея, используемого для наклейки этикеток на ящики с готовой продукцией. Сальмонеллы методом ПЦР были обнаружены в 20 образцах (58,9±8,4%), при бактериологическом исследовании - в 18 (52,9±8,6%). Во всех пробах, давших положительный результат в бактериологическом анализе, сальмонеллы были выявлены и методом ПЦР.

При плановой проверке санитарного состояния продовольственного рынка Советского района г.Н.Новгорода было проведено исследование 38 смывов с продуктов питания, торгового оборудования, одежды и рук продавцов. Методом ПЦР сальмонеллы выявлены в 7 образцах (18,4±6,3%), при микробиологическом исследовании получен один положительный результат (2,6±2,5%). Сальмонеллы обнаружены только в смывах с продукции птицеводства, оборудования, контактирующего с такой продукцией и рук продавцов, торгующих птицей.

Тест- система была также апробирована при расследовании вспышки сальмонеллеза пищевого характера, зарегистрированной в г. Саранске осенью 1999 г. Предполагалось, что фактором передачи инфекционного агента является майонез производства Нижегородского масложиркомбината. Было проведено исследование 15 проб майонеза и 9 образцов яичного порошка, использованного для изготовления этой партии майонеза. Методом ПЦР сальмонеллы выявлены в одной из проб майонеза и одной из проб яичного порошка. Микробиологическим методом бактерии рода Salmonella в данном материале обнаружить не удалось.

Как правило, при проведении санитарно-эпидемиологических исследований метод ПЦР существенно превосходил по эффективности бактериологический метод. Исключение составили результаты проверки Балахнинской птицефабрики. В данном случае обоими методами были показаны близкие значения выявления бактериий рода Salmonella (58,9% - ПЦР и 52,9% - бактериологическим методом). Возможно, это связано с высокой контаминацией птицеводческих производств сальмонеллами.

С 2002 г. совместно с сотрудниками детской инфекционной больницы №8 Н. Новгорода с использованием тест-системы «Ампли-сенс — Salmonella species 250» проводятся исследования клинического материала (проб фекалий) от детей с диагнозом «ОКЗ». Нами обследовано 526 пациентов. Методом ПЦР бактерии рода Salmonella выявлены у 169 детей, что составило 32,1±2,0% от общего числа обследованных. При параллельном бактериологическом исследовании сальмонеллы выделены у 76 человек (14,8±1,5%). Методом ПЦР бактерии рода Salmonella выялялись в 2,2 раза достоверно чаще (t=6,92)

Таким образом, проведенные нами исследования клинического материала, смывов с объектов внешней среды, продуктов питания продемонстрировали значительное преимущество ПЦР-детекции сальмонелл по сравнению с микробиологическим методом. Частота выявления инфекционного агента методом ПЦР была выше в 2 раза аналогичного показателя при бактериологическом анализе. Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности использования метода ПЦР в клинической практике с целью лабораторного обеспечения эпиднадзора за данной инфекцией (для первичной индикации сальмонелл в клиническом материале от больных с подозрением на ОКИ и пищевую токсикоинфекцию; в продуктах питания и объектах окружающей среды при расследовании вспышечной заболеваемости).

Дата добавления: 2015-07-20