|
Читайте также: |
В настоящее время международным «золотым стандартом» лабораторной диагностики H.pylori является комплексное обследование, включающее три метода: бактериологический, гистологический и уреазный тест. Для большинства отечественных практических лечебных учреждений такой диагностический комплекс не доступен из-за сложности и высокой стоимости.
Поскольку использованные в нашей работе ПЦР тест-системы для детекции H.pylori являлись экспериментальными, не было достаточного опыта их использования и информации об их применении в практической диагностике, представляло интерес провести сопоставление результатов, полученных методом ПЦР, с результатами традиционных методов выявления H.pylori, применяемых в отечественной медицинской практике. I В лечебно-профилактических учреждениях г. Нижнего Новгорода чаще
; других используется цитологический метод детекции H.pylori (световая
микроскопия мазков-отпечатков слизистой оболочки желудка). Нами было ^ проведено параллельное исследование 107 биоптатов слизистых желудка и
12-перстной кишки на наличие Н.ру1оп методами ПЦР и световой микроскопии. Цитологические исследования проводились в лаборатории клиники ФГУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора. Полученные результаты представлены в таблице 15.
Таблица 15
Сравнение результатов выявления Н.ру1оп методами ПЦР и световой микроскопии, полученных при параллельном исследовании (п =107)
| Метод исследования | ПЦР | Мкроскопия | ||
| Результат | *Н.р.+ | Н.р.- | Н.р.+ | Н.р.- |
| В абс. значениях | ||||
| В% | 75,7±4,1 | 24,29±4,1 | 30,8±4,4 | 69,16± 4,5 |
| «Н.р.+» - Н. pylori выявлен «Н.р.-» - Н. pylori не выявлен |
В результате сравнительного исследования Н.ру1оп методом ПЦР выявлен в 75,7±4,1% случаев, а световой микроскопией - в 30,8±4,4%. Показаны достоверные различия в обнаружении возбудителя этими двумя методами (1 = 7,48). Методом ПЦР Н.ру1оп выявляется в 2,5 раза эффективнее, чем методом световой микроскопии. При микроскопировании Н.ру1оп был найден только в 33 из 82 проб, положительных в ПЦР.
При сравнении методов ПЦР и световой микроскопии получены 4 варианта результатов (таблица 16).
Таблица 16. Варианты результатов, полученных при параллельном исследовании биоптатов на наличие Н.ру1оп методами ПЦР и световой микроскопии
|
| «Нр+» - H.pylori выявлен «Нр-» - Н. pylori не выявлен |
Совпадение результатов ПЦР и микроскоп ирования составило 53,3±4,8%: в 29,9±4,4% случаев в этих тестах были положительные результаты получены, в 23,4±4,1% - отрицательные.
Достаточно часто (45,8±4,8%) встречались варианты, при которых H.pylori выявлялся ПЦР, а световая микроскопия давала отрицательный результат. Наличие таких вариантов вполне логично, так как метод ПЦР обнаруживает низкие концентрации Н. pylori, которые не определяются визуально. Кроме того, ПЦР выявляет кокковые формы H.pylori, которые не идентифицируются методом световой микроскопии.
Единственный вариант, при котором получен отрицательный результат ПЦР и положительный методом световой микроскопии, может быть объяснен тем, что помимо H.pylori, на слизистой желудка встречаются другие виды микроорганизмов (представители рода Campylobacter или дрожжи), которые имеют сходную с H.pylori форму клетки. При микроскопировании они могут быть идентифицированы как H.pylori, но в ПЦР дадут отрицательный результат. Таким образом, показано существенное преимущество ПЦР-детекции Н. pylori по сравнению с методом световой микроскопии.
Нами, совместно с сотрудниками ООО «Санаторий имени ВЦСПС» г. Н. Новгород, проведено ПЦР-исследование 38 образцов желудочного сока от больных с гастродуоденальной патологией на наличие Н. pylori. У тех же пациентов хеликобактер параллельно выявляли методом brush-биопсии (микроскопией мазка пристеночной слизи желудка) [33]. Диагностика хеликобактерной инфекции методом brush-биопсии проводилась в ГУЗ «Нижегородский областной клинический диагностический центр». Результаты сравнения этих двух методов представлены в таблице 17.
Таблица 17.
Сравнение результатов выявления Н. pylori методами ПЦР и brush- биопсии.
| Количество обследованных | Варианты результатов ПЦР (в абс. значениях и %) | |||
| ПЦРНр+ Brush- биопсия Нр+ | ПЦРНр-ь Brush- биопсия Нр- | ПЦРНр- Brush- биопсия Нр+ | ПЦРНр- Brush- биопсия Нр- | |
| 100% | 34,21±7,7 | 18,42±5,9 | 10,53±5,0 | 36,84±7,8 |
| «Нр+» - H.pylori выявлен «Нр-» - Н. pylori не выявл |
Эффективность выявления Н. pylori методом ПЦР была выше и составила 83,3±6,0% от числа всех положительных проб. При исследовании пристеночной слизи желудка методом brush-биопсии этот показатель составил 70,8±7,4%. Статистическая обработка полученных результатов значимых различий в выявлении Н. pylori не выявила (t < 2,6). В 71±7,4% случаев результаты, полученные этими методами, совпадали. Несовпадение результатов (в 7 случаях ПЦР выявляла Н. pylori, brush-биопсия давала отрицательный результат; в 4 случаях результат ПЦР был отрицательным, а brush-биопсия - Н. pylori-положительна) могут быть объяснены теми же причинами, что и несовпадение результатов ПЦР и световой микроскопии отпечатков биоптатов.
Нами проведен также сравнительный анализ ПЦР-детекции Н. pylori и гистологического метода. У 30 детей - пациентов ФГУ «Нижегородский НИИ детской гастроэнтерологии Росмедтехнологий» проводилось ПЦР- исследование желудочного сока и микроскопирование гистологических препаратов слизистой оболочки желудка. Результаты гистологических исследований предоставлены ФГУ «Нижегородский НИИ детской гастроэнтерологии Росмедтехнологий». Методом ПЦР Н. pylori был выявлен в 33,3±8,6% исследованных проб желудочного сока, в гистологических
препаратах возбудитель был идентифицирован в 93,3±4,6% случаях. Столь высокий процент инфицированности детей, полученный гистологическим методом, не согласуется с данными литературы [13, 93, 142]. Для выяснения причин столь большой разницы результатов ПЦР и гистологического метода нами было проведено ПЦР-исследование парафинизированных срезов биоптатов слизистой желудка трех пациентов, у которых гистологическим методом зафиксирован положительный результат. Н. pylori не был обнаружен ни в одном из образцов. Применение внутреннего контроля показало отсутствие ингибирования ПЦР. На основании результатов ПЦР- исследования парафинизированных срезов было сделано предположение о высокой вероятности ложноположительных результатов при использовании гистологического метода, что и могло стать причиной гипердиагностики.
Полученные при проведении сравнительных исследований данные свидетельствуют о значительном субъективизме методов диагностики Н. pylori, основанных на идентификации возбудителя по его морфологическим особенностям. Для успешного проведения диагностики методами, основанными на микроскопии, требуется высокая квалификация исполнителя. Вероятность ложноположительных и ложноотрицательных результатов при этом остается высокой. Из морфологических методов диагностики хеликобактерной инфекции наиболее объективным оказался метод brush-биопсии. С его помощью были получены результаты, максимально совпадающие с результатами ПЦР.
На данном этапе работы нами доказана диагностическая ценность метода ПЦР при выявлении Н. pylori и его преимущества по сравнению с цитологическим (световая микроскопия, brush-биопсия), гистологическим методами диагностики хеликобактерной инфекции, чаще всего используемыми специализированными медицинскими учреждениями г. Нижнего Новгорода и Российской Федерации.
2.2.3.3. Изучение распространенности H.pylori у больных с различными формами гастродуоденальной патологии
Поскольку до появления ПЦР тест-систем, выявление Н. pylori у больных с гастродуоденальной патологией г. Нижнего Новгорода проводилось недостаточно специфичными методами, на наш взгляд представлялось важным получить более объективную информацию о распространении данного инфекционного агента. Для этого нами проведено обследование больных разных возрастных групп с различными типами гастродуоденальной патологии методом ПЦР.
Одной из актуальных проблем хеликобактерной инфекции является вопрос о детской инфицированности Н. pylori. Для его изучения проведено ПЦР обследование детей с различными заболеваниями органов пищеварительной системы - пациентов ФГУ «Нижегородский НИИ детской гастроэнтерологии Росмедтехнологий». Материалом для выявления Н. pylori у детей являлся желудочный сок.
При обследовании 285 детей в возрасте от 8 до 17 лет Н. pylori выявлен у 168 человек, что составило 58,9±2,9%. Полученные нами данные о частоте выявления Н. pylori среди детей с гастродуоденальной патологией согласуются с результатами целого ряда отечественных исследователей [13, 36, 93], которые свидетельствуют о достаточно высокой инфицированности (60-70%) детского населения в России.
Частота выявления Н. pylori у детей разных возрастов и при различных типах гастродуоденальной патологии представлена на рисунках 15 и 16.
□ Всего обследовано ■ НР+
8л
9л
Юл 11л 12л 13л 14л 15л 16л возраст
|
Рис. 15. Частота выявления Helicobacter pylori у детей с гастродуоденальной патологией в разных возрастных группах; «НР+» - Н. pylori выявлен
| -------------- | о HPf,% | |||||
| ХГД ХЭГД ЯБДПК ЯБДПКХГД Тип патологии |
Рис. 16 Частота выявления Helicobacter pylori у детей с различными типами гастродуоденальной патологии
«НР+» - Н. pylori выявлен
ХГД - хронический гастродуоденит
ХЭГД - хронический эрозивный гастродуоденит
ЯБДПК - язвенная болезнь ДНК
ЯБДПК ХГД - язвенная болезнь ДНК на фоне хронического гастродуоденита
Высокая частота выявления возбудителя хеликобактерной инфекции у детей в возрасте 8 лет (57,1± 13,2%), позволяет говорить о ранней инфицированности населения нашей страны. Подобная ситуация характерна для стран с развивающейся экономикой, низким социально-экономическим уровнем, что наряду с несоблюдением санитарно-гигиенических правил приводит к ранним клиническим проявлениям хеликобактерной инфекции [93].
Установлены следующие показатели инфицированности Н.ру1оп детей с различными типами гастродуоденальных заболеваний (рис. 16): -при хроническом гастродуодените — 60,3±4,9%; -при хроническом эрозивном гастродуодените - 45,7±5,0%; -при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки — 71,6±6,4%;
|
| I НР- I НР+ |
| гба гдба гса |
| рдл ядпк гкж упядк упяж |
| гдса эг эгд яж эб тип патологии |
| Рис. 17. Частота выявления Helicobacter pylori методом ПЦР при различных типах гастродуоденальной патологией среди взрослого населения «НР+» - Н. pylori выявлен, «НР-» - Н. pylori не выявлен, ГДБА - гастродуоденнт без признаков атрофии; ГСА - гастрит с признаками атрофии; ГДСА -гастродуоденнт с признаками атрофии; ЭГ - эрозивный гастрит; ЭГД - эрозивный гастродуоденнт; ЯЖ — язва желудка; ЭБ - эрозивный бульбит; РДЛ - рубцовая деформация луковицы двенадцатиперстной кишки; ЯДПК - язва двендцатиперстной кишки; ГКЖ- гастрит культи желудка; УПЯДК - состояние после ушивания язвы двенадцатиперстной кишки; УПЯЖ - состояние поле ушивания язвы желудка. |
Для изучения распространения Н.ру1оп у взрослых больных с разными типами гастродуоденальной патологии было проведено ПЦР обследование 439 человек в возрасте от 18 до 79 лет. Н.ру1оп был выявлен у 364 человек (82,9±1,8%). Результаты представлены на рисунке 17.
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% f- 10% 0%
При всех типах гастродуоденальной патологии наблюдается высокая инфицированность больных H.pylori, что свидетельствует о способности этого микроорганизма провоцировать развитие и осложнять течение различных форм гастродуоденальных заболеваний. Особо следует отметить 100%-ную частоту выявления H.pylori у лиц с резекцией желудка (20 человек) и ушиванием перфоративной язвы (46 человек). Эти данные позволяют сделать вывод о недостаточной эффективности эррадикации H.pylori только при хирургических вмешательствах и необходимости проведения своевременной специфической антибактериальной терапии.
Полученная информация о распространенности Н. pylori среди больных с различными типами гастродуоденальной патологии объективна, согласуется с имеющимися отечественными и зарубежными литературными данными по распространенности H.pylori, что свидетельствует о достаточно высокой специфичности использованной ПЦР тест-системы [4, 32, 73, 214, 356].
2.2.3.4. Использование полуколичественного варианта ПЦР-детекции H.pylori для оценки эффективности антихеликобактерной терапии.
Большинство существующих методов диагностики не позволяют осуществлять ранний контроль эффективности антихеликобактерной терапии. Для контроля эффективности эрадикации H.pylori нами разработан полу количественный вариант ПЦР, позволяющий оценивать изменения уровня обсемененности слизистых H.pylori до и после лечения.
Ранее проведенные исследования показали, что наиболее интегративным и информативным субстратом для ПЦР-детекции H.pylori является утренняя тощаковая порция желудочного сока. Испытание метода проведено при обследовании 46 человек - мужчин в возрасте 17-58 лет, находящихся на реабилитации после ушивания перфоративной язвы желудка или двенадцатиперстной кишки в стационаре ООО «Санаторий им. ВЦСПС» [33].
Метод базируется на ПЦР детекции хеликобактера в десятикратных разведениях ДНК, выделенной из проб желудочного сока. Предварительно, до лечения, H.pylori был выявлен в желудочном соке у 40 человек (78,3±6,1% больных). После проведенного лечения они были повторно обследованы. Желудочный сок отбирали через 1-2 недели после окончания терапии. У 18 человек (45±7,9%) H.pylori не выявлялся, у остальных 22 пациентов (55±7,9%) Н. pylori был обнаружен и после лечения. ДНК из проб этих пациентов (взятых до и после лечения) разводили в 10, 100, 1000 и в каждом из разведений проводили ПЦР-детекцию H.pylori. Сравнивали электрофореграммы образцов, полученных до и после лечения. При этом в 13 случаях (32,5±7,4%) не наблюдалось изменений концентрации возбудителя в пробах, забранных до и после лечения. H.pylori выявлен во всех разведениях (рис 18, 19.), что свидетельствовало о необходимости продолжения лечения с использованием других схем эррадикации.
|
10"' Ю"2 10"3 10"1 10"2 10"3 К+ К- до лечения после лечения
Рис. 18. Электрофореграмма продуктов ПЦР разведений ДНК Helicobacter pylori из проб желудочного сока
У 9 пациентов (22,5±6,6%) ДНК H.pylori выявлена во всех разведениях до лечения, а после терапии - только в исходной пробе желудочного сока (на электрофореграмме наблюдалось слабое свечение специфического фрагмента - рис.). Детекция низких концентраций Н.ру1оп может быть объяснена амплификацией ДНК погибшего возбудителя. Такой результат ПЦР рассматривался нами как показатель успешной терапии, что в последствие было подтверждено анализом отдаленных результатов.
1 23456789 10
исх 10"' 10"2 10"3 исх 10"' 10"2 Ю-3 К+ К- проба проба
до лечения после лечения
|
Рис. 19. Электрофореграмма продуктов ПЦР разведений ДНК Helicobacter pylori из проб желудочного сока.
У пациентов с упешной эррадикацией H.pylori (сигнал на электрофореграмме не выявлялся или был слабый для исходной пробы), при проведении контрольной эзофагогастродуоденоскопии наблюдались эндоскопические и клинические улучшения: рубцевание язв, эпителизация эрозий, уменьшение активности гастродуоденита. В течение года больные этой группы отмечали хорошее самочувствие, не обращались за медицинской помощью. В то же время, у трех больных без эффекта эррадикации H.pylori (титр H.pylori до и после лечения одинаков), отказавшихся от повторного курса лечения, через 17-18 месяцев отмечен рецидив язвенной болезни.
Проведенные исследования показали, что наряду с высокой чувствительностью, специфичностью и низкой инвазивностью (за счет исследования желудочного сока) метод ПЦР является информативным при оценке эффективности противохеликобактерной терапии через 1-2 недели после ее окончания. Результаты, полученные с использованием полуколичественного варианта ПЦР-детекции H.pylori, имеют прогностическое значение при оценке предполагаемой успешности проведенного лечения.
2.2.3.5. Использование ПЦР для определения резистентности H.pylori к атибиотикам-макролидам.
Антибиотики ряда макролидов являются одними из важнейших препаратов, применяемых при лечении гастродуаденальной патологии ассоциированной с хеликобактером. В связи с этим представляло интерес оценить распространение резистентных форм H.pylori в микробной популяции. Устойчивость к антибиотикам определяли с помощью ПЦР тест- системы «Эритропол» (фирма «Литех», г. Москва), выявляющей ген метилазы, которая модифицирует бактериальные рибосомы и делает бактерию устойчивой к макролидам. Исследованы 97 образцов, в которых ранее выявлена ДНК Н. pylori. Устойчивые варианты выявлены в 3 случаях (3,1±1,8%), что свидетельствует о том, что в Нижегородском регионе преобладают штаммы Н. pylori чувствительные к макролидам. Проблем с интерпретацией результатов не возникало. Диагностикум может быть рекомендован для использования в практике.
2.2.3.6. Изучение возможности использования метода ПЦР для выявления генов факторов патогенности Helicobacter pylori
Способность Н. pylori обусловливать развитие гастродуоденальных заболеваний связывают с наличием у него комплекса факторов патогенности. Наиболее значимыми факторами патогенности Н. pylori являются: уреаза, вакуолизирующий цитотоксин, белки, кодируемые островком патогенности [264]. Одной из задач нашей работы являлась апробация отечественных ПЦР тест-систем для выявления генов факторов патогенности Н. pylori: гена CagA, присутствующего у, так называемых, токсигенных штаммов Н. pylori (тест-система «ДиаГен-Helicobacter» фирма «Лагис», г. Москва) и гена вакуолизирующего цитотоксина VacA (тест-система «Хеликопол VA», фирма «Литех». Москва).
Материалом для исследования служили биоптаты слизистой, желудочный сок, собранные у пациентов с различными формами гастродуоденальной патологии. В ходе работы все пробы были предварительно исследованы на наличие H.pylori ПЦР тест-системой «АмплиСенс-Helicobacter pylori-520». Пробы, в которых хеликобактер был выявлен (п=127), проанализированы на наличие гена CagA - маркера «острова патогенности».
Ген CagA был обнаружен в 97 пробах, что составило 76,4±3,8%. В 30 пробах (23,6±3,8%) ген CagA не выявлен. Было отмечено, что пробы, имевшие слабый сигнал на электрофореграмме при детекции H.pylori давали отрицательный результат при использовании тест-системы на ген CagA. При использовании этой тест-системы также наблюдалось значительное ослабление сигнала на электрофореграмме по сравнению с системой «АмплиСенс-Helicobacter pylori-520». На основании этого мы предположили, что тест-система на маркер «острова патогенности» обладает меньшей чувствительностью, чем тест-система для ПЦР-детекции Н. pylori, базирующаяся на выявлении 16S рРНК гена.
Для подтверждения данного предположения была проведена полуколичественная оценка содержания ДНК Н. pylori в «CagA+» и «CagA-» пробах. Исследования показали, что все «CagA+» пробы, давали положительный результат на наличие гена 16S рРНК при разведении в 10, 100 и 1000 раз. Среди «CagA-» проб, наряду с пробами с низкой концентрацией ДНК Н. pylori (дававшими сигнал на электрофореграмме только с исходной пробой), выявлено 6 проб с высокой концентрацией ДНК. Полученные результаты позволили сделать следующие заключения:
1. Тест-система для выявления гена CagA уступает в чувствительности тест-системе на ген 16S рРНК H.pylori.
2. Выявления гена CagA целесообразно проводить в пробах с высоким содержанием ДНК H.pylori.
3. При работе с пробами с низкой концентрацией ДНК возможно получение ложноотрицательного результата.
В дальнейшем при выявлении гена CagA мы исследовали пробы, в которых H.pylori выявлялся при разведении как минимум в 10 раз. Из-за низкой чувствительностьи тест-системы на ген токсигенности в 8 случаях из 127 определить наличие или отсутствие гена CagA не удалось. По остальным параметрам апробированная тест-система для выявления гена CagA зарекомендовала себя удовлетворительно - была удобна в работе, не давала неспецифического синтеза и ложноположительных результатов.
Проведенные исследования выявили широкую распространенность «CagA+»-urraMMOB в популяции H.pylori. Было показано, что такие штаммы чаще колонизируют слизистую оболочку желудка (64,3±4,9% всех «CagA+»- штаммов) и ассоциированы преимущественно с заболеваниями желудка. Большинство CagA-отрицательных вариантов Н. pylori (82±7,0%) выделено от больных с поражением двенадцатиперстной кишки.
Были также проведены испытания ПЦР тест-системы «Хеликопол VA» фирмы «Литех», Москва для выявления и определения аллельного варианта гена вакуолизирующего цитотоксина VacA. Для исследования взяты образцы, содержащие «CagA+» и «CagA-» варианты Н. pylori, (всего 43 «CagA+» и 7 «CagA-» изолятов). Из данных литературы известно, что ген VacA может быть представлен несколькими аллельными вариантами двух вариабельных участков гена (s и ш) [295]. Предполагается, что генотипы H.pylori slml и slm2 имеют максимальный или средний уровень секреции цитотоксина, H.pylori с генотипом s2m2 проявляет незначительную токсическую активность.
После проведения оптимизации состава тест-системы «Хеликопол VA» и программы амплификации (см. раздел 2.2.1. Формирование материальной
базы для проведения исследований) получены следующие данные распространении гена VacA у H.pylori (таблица 18)
Таблица 18
Выявления вариантов Vac А гена с использованием тест тест-системы «Хеликопол VA» у ПЦР-изолятов H.pylori (п=50)
| Кол-во VacA образцов | Выявленные варианты гена Vac А | ||||||
| slml | slm2 | s2m2 | slml/m2 | sl | ml | т2 | |
| Абс. 33 | |||||||
| 100% | 10,0±5,5 | 18,0±6,7 | 2,0±2,4 | 6,0±4,1 | 10,0±5,2 | 2,0±2,4 | 18,0±6,7 |
Ген VacA выявлен у 33 (66±6,7%) ПЦР-изолятов H.pylori, что совпадает с показателями других исследователей. По данным литературы ген VacA встречается у 50-60% штаммов Н pylori [61, 398].
Из 33 VacA+ проб полная аллельная структура гена Vac А была установлена только у 18 образцов. В 5 случаях был выявлен аллельный вариант slml; в 9 - slm2; в 1 - s2m2. Кроме того, в 3 случаях был обнаружен вариант slml/m2, что позволяет предположить наличие в образце двух штаммов H.pylori с различной структурой гена VacA - slml и slm2 или присутствие возбудителя с гибридным вариантом гена VacA - ml-подобный фрагмент/т2 [295]. В 15 пробах амплифицировался только один из пары исследуемых фрагментов гена VacA (либо т, либо s). В одном случае был определен ml; в 9 - т2; в 5 — sl. Такие результаты расценивались как выявление гена VacA. Значительное количество образцов, в которых не удалось установить полный вариант гена VacA, объясняется низкой чувствительностью тест-системы «Хеликопол VA», которая обусловлена конкуренцией за праймеры и другие компоненты реакционной смеси между специфическими и неспецифическими мишенями, причем конкуренция в
случае праймеров к sl, s2, rn2 аллелям складывается не в пользу специфических фрагментов.
Полученные результаты не позволяют рекомендовать тест-систему «Хеликопол VA» для проведения практических исследований по выявлению токсигенных штаммов Н. pylori. Она сложна в работе и малоэффективна. 2.2.3.7. Изучение гетерогенности нуклеотидных последовательностей фрагментов гена CagA Н. pylori методом гетеродуплексного анализа.
Недоступность бактериологических методов работы с H.pylori большинству практических лечебных учреждений крайне затрудняет проведение эпидемиологических исследований этой инфекции, в частности, изучение штаммового разнообразия H.pylori.
Одной из альтернатив микробиологическому методу для получения внутривидовых характеристик может быть сравнение нуклеотидных последовательностей средневариабельных фрагментов хромосомной ДНК бактерий. Нами проведено исследование возможности дифференцирования ПЦР-изолятов H.pylori на основе сравнения фрагментов гена CagA.
Наиболее простым и доступным методом для оценки вариабельности нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК размером не более 1000 п.н. является метод гетеродуплексного анализа [148]. Он не требует использования дорогостоящих реактивов и оборудования. Метод основан на электрофоретическом разделении денатурированных, а затем ренатурированных комплементарных и частично комплементарных фрагментов ДНК. При гибридизации цепей с неполной гомологией образуются единичные нарушения структуры двойной спирали - петли, шпильки. Такой частично гомологичный фрагмент ДНК носит название гетеродуплекс. Участки нарушения структуры двойной спирали в гетеродуплексе приводят к уменьшению его подвижности при электрофорезе в полиакриламидном геле. Контролем подвижности является фрагмент ДНК, образовавшийся в результате гибридизации полностью комплементарных последовательностей - гомодуплекс [148].
Этот метод и был использован нами для сравнения фрагментов гена CagA десяти ПЦР-изолятов H.pylori (исследовалось 10 проб в которых ранее методом ПЦР установлено наличие H.pylori CagA+). Предварительно была оценена вариабельность фрагментов CagA отдельных изолятов. Для этого ампликоны всех проб была денатурирована, затем ренатурированы и подвергнуты электрофорезу в полиакриламидном геле. Для 9 из 10 образцов на электрофореграмме наблюдали формирование гомодуплексов, что свидетельствовало о полном совпадении нуклеотидных последовательностей фрагментов. Один из изолятов образовывал два фрагмента, следовательно, в нем присутствовали отличающиеся последовательности ДНК, что могло свидетельствовать о наличии двух штаммов Н. pylori с отличающимися нуклеотидными последовательностями гена CagA.
Для получения гетеродуплексов 10 фрагментов гена CagA попарно смешивали во всех возможных комбинациях денатурировали, ренатурировали и анализировали подвижность электрофорезом в полиакриламидном геле. При неполной гомологии исследуемых фрагментов на электрофореграмме наблюдали образование двух полос: нижняя, соответствующая гомодуплексу, образована гибридизацией фрагментов одного из изолятов; верхняя - гетеродуплекс, результат реассоциации фрагментов из разных проб (рис. 20, треки 6 и 7). Если смешанные изоляты имели полностью гомологичные фрагменты, то на электрофореграмме регистрировалась только полоса гомодуплекса (рис 20. треки с 1 по 5 и с 9 по 12). Результаты гетеродуплексного анализа фрагментов гена CagA представлены в таблице 19.
wm
frfiltf
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 K+ Рис. 20. Электрофореграмма гомодуплексов и гетеродуплексов фрагментов гена CagA Helicobacter pylori. Треки 6 и 7 содержат гетеродуплексы
Проведенные исследования показали, что фрагмент гена CagA одной из 10 проб (проба №3) образовывал гетеродуплексы в комбинациях со всеми остальными образцами, что свидетельствует об отличии последовательности нуклеотидов гена CagA этого изолята от остальных. Фрагменты гена CagA восьми проб (пробы №№ 1, 2, 4, 5, 8, 9, 10) в комбинациях между собой гетеродуплексов не давали. По-видимому, они имели высокую степень гомологии. Кроме того, на предварительном этапе выявлена одна проба (№6), которая при ее денатурации и ренатурации формировала гетеродуплекс. Этот вариант также дал гетеродуплексы со всеми другими 9 изолятами. Данный факт, возможно, объясняется высокой степенью гетерогенности гена CagA этого изолята. Но наиболее вероятно, что в данном случае пациент был инфицирован двумя штаммами Н. pylori, несущими отличающиеся по нуклеотидному составу гены CagA.
Таблица 19
|
| «+» - наблюдалось образование гетеродуплекса, |
«-» - образования гетеродуплекса не наблюдалось
| Результаты гетеродуплексного анализа фрагмента гена CagA H.pylori |
Таким образом, методом гетеродуплексного анализа выявлены два варианта изолятов Н. pylori, имеющих различия в первичной структуре гена CagA. Один из них более распространенный (выявлен в 8 из 9 случаев), другой - «минорный», встречается реже (1 из 9). Полученные результаты позволяют предположить, что выбранная последовательность гена CagA может быть использована для дифференциации ПЦР-изолятов H.pylori, так как при сравнении этих последовательностей получен интерпретируемый результат - не наблюдалось «монотонной» картины (все изоляты либо 100% гомологичны, или все 100% различаются). Данный фрагмент генома может быть рекомендован к использованию при изучении штаммового разнообразия H.pylori.
Дата добавления: 2015-07-20; просмотров: 161 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая страница | | | следующая страница ==> |
| Выявление H.pylori в различных типах клинического материала | | | Разработка алгоритма обследования больных с гастродуоденальной патологией на инфицированность H.pylori методом ПНР |