Экспериментальный протокол

1. Возьмите три пробирки для сбора фракций и подпишите их «1», «2», «3». Поставьте пробирки в штатив. Снимите крышки с колонки и дайте буферу полностью стечь (поставьте колонку в свободную пробирку для слива). Когда верхняя граница буфера дойдет до границы сорбента, аккуратно перенесите колонку в пробирку для сбора фракций «1». Не пытайтесь засунуть колонку как можно более плотно в пробирку, в этом случае она не будет течь.

1. Предположите, что, как вы думаете, произойдет на следующих этапах и запишите ваши предположения вместе с реальными наблюдениями в таблицу на странице 45.
2. Используя новую пипетку, аккуратно нанесите 250 мкл супернатанта (в буфере для связывания) на колонку. Расположите носик пипетки так, чтобы жидкость медленно стекала по стенке колонки. Посмотрите на колонку под ультрафиолетом, запишите ваши наблюдения. Дайте всему объему супернатанта стечь в пробирку для сбора фракций 1.

1. Перенесите колонку в пробирку для сбора фракций #2. Промытой пипеткой так же по стенке налейте 250 мкл промывочного буфера и подождите, пока он протечет. В это время подумайте, что вы можете увидеть. Посмотрите на колонку под УФ и запишите ваши наблюдения в таблицу на стр. 45.

1. Перенесите колонку в пробирку 3. Промытой пипеткой нанесите на колонку 750 мкл ТЕ (буфера для элюции). Подождите, пока весь буфер протечет. Снова сделайте предположение о том, что вы можете наблюдать, и потом посмотрите на колонку под УФ. Запишите результат в таблицу на стр. 45.

1. Осмотрите все пробирки для сбора фракций под ультрафиолетом. Обратите внимание на разницу в цвете между фракциями. Замотайте пробирки пищевой пленкой и поставьте в холодильник до следующего занятия.

Вопросы к уроку 5

1. Перечислите ваши предсказания и наблюдения за образцом, при добавлении к нему различных буферов для хроматографии.

Номер пробирки для сбора фракций	Предсказания	Наблюдения за колонкой и пробиркой под УФ
#1 Колонка в буфере для связывания
#2 Колонка в промывочном буфере
#3 Колонка в буфере для элюции

1. Используя заполненную таблицу, сравните совпали ли ваши предсказания с наблюдаемыми результатами для каждого буфера.

А. Буфер для связывания

Б. Промывочный буфер

В. Буфер для элюции

1. Основываясь на своих результатах, объясните назначение каждого буфера. (подсказка: названия буферов говорят сами за себя)

А. Буфер для уравновешивания

Б. Буфер для связывания

В. Буфер для промывки

Г. Буфер для элюции (TE)

1. В каких буферах высокая концентрация соли, а в каких низкая? Почему должно быть именно так?

1. Удалось ли вам успешно выделить и очистить зеленый флуоресцентный белок из клонированных бактериальных клеток? Обоснуйте ваш ответ.

Дата добавления: 2015-08-10