Урок 5 Третья стадия очистки: хроматография белка

На этой заключительной стадии очистки вы наносите приготовленный бактериальный лизат на колонку для гидрофобной хроматографии. Помните, что GFP содержит множество гидрофобных аминокислотных остатков, которые делают его гораздо более гидрофобным чем большинство бактериальных белков. Сначала вы пропускаете супернатант, содержащий бактериальные белки и GFP в высокосолевом буфере через колонку. Соль заставляет пространственную структуру белка изменится таким образом, что гидрофобные участки оказываются на поверхности молекулы, а гидрофильные («любящие воду») оказываются внутри.

Колонка, которая стоит на вашем столе, наполнена сорбентом, состоящим из микроскопических гидрофобных шариков. Когда ваш образец в буфере с высокой концентрацией соли протекает через сорбент, гидрофобные белки прилипают к шарикам, тем сильнее, чем выше степень гидрофобности белка. (или, что тоже самое, чем более белки гидрофильные, тем меньше они связываются с сорбентом). Если понизить концентрацию соли в буфере, пространственная структура белков опять меняется так, что гидрофобные участки прячутся внутрь молекулы, а гидрофильные оказываются на поверхности. В таком состоянии белок не может связываться с колонкой и смывается с нее.

Вы будете использовать эти четыре раствора для проведения хроматографии:

Буфер для уравновешивания -буфер с высокой концентрацией соли (2 М (NH₄)₂SO₄)

Буфер для связывания -буфер с очень высокой концентрацией соли (4 М(NH₄)₂SO₄)

Буфер для промывки -буфер со средней концентрацией соли (1.3 M (NH₄)₂SO₄

Буфер для элюции – буфер с очень низкой концентрацией соли (ТЕ, 10 mM Tris/EDTA)

Дата добавления: 2015-08-10