Потому что супернатант состоит из среды выращивания и не содержит GFP.

4. Объясните, почему бактериальная клеточная стенка рвется при замораживании. (подсказка: что происходит с закрытой бутылкой воды, если ее заморозить?)

Лед занимает больший объем, чем вода. Когда бактериальная клетка замерзает, объем цитоплазмы увеличивается. Это создает давление на клеточную стенку, и она лопается.

1. Какова цель разрушения, или лизиса бактерий?

Бактерии необходимо разрушить, чтобы высвободить находящийся в цитоплазме GFP, который далее может быть очищен с помощью хроматографии.

Ответы на вопросы к уроку 4

1. Какого цвета был осадок на этой стадии эксперимента? Какого цвета был супернатант? О чем это вам говорит?

Осадок должен быть белого или бледно-зеленого цвета. Супернатант должен ярко светиться зеленым. Цвет сигнализирует о том, что зеленый флуоресцентный белок высвободился из клеток и остался растворен в супернатанте. Гораздо более бледный цвет осадка говорит о том, что большая часть GFP высвобождается из клеток.

1. Почему вы отбрасываете осадок на этой стадии?

Осадок содержит нежелательные компоненты – куски клеточной стенки, мембраны, хромосомную ДНК. В нем совсем мало или вовсе нет GFP и его можно отбросить.

1. Кратко опишите суть хроматографии белка и объясните ее назначение в этой работе.

Хроматография белка это метод отделения интересующего нас белка от других молекул. Он основан на разном сродстве белков к сорбентам, через которые они протекают. GFP обладает ярко выраженными гидрофобными свойствами, что позволяет отделить его от других белков с помощью гидрофобной хроматографии.

Ответы на вопросы к уроку 5

1. Перечислите ваши предсказания и наблюдения за образцом, при добавлении к нему различных буферов для хроматографии.

Номер пробирки для сбора фракций	Предсказания	Наблюдения за колонкой и пробиркой под УФ
#1 Колонка в буфере для связывания	GFP должен связываться с колонкой	GFP виден как зеленое кольцо в верхней части колонки
#2 Колонка в промывочном буфере	GFP должен оставаться связанным с колонкой	GFP остается на колонке в виде широкой полосы
#3 Колонка в буфере для элюции	GFP должен смываться (элюироваться) с колонки	GFP в виде кольца перемещается вниз по колонке и вытекает в пробирку 3

1. Используя заполненную таблицу, сравните совпали ли ваши предсказания с наблюдаемыми результатами для каждого буфера.

А. Буфер для связывания – GFP связывается с колонкой

Б. Промывочный буфер – GFP остается связанным с колонкой

В. Буфер для элюции – GFP элюируется с колонки

1. Основываясь на своих результатах, объясните назначение каждого буфера. (подсказка: названия буферов говорят сами за себя)

А. Буфер для уравновешивания – Этот буфер готовит колонку для нанесения образца, содержащего GFP. Этот буфер содержит такую же концентрацию соли, как и содержащий GFP супернатант (после добавления туда буфера для связывания)

Б. Буфер для связывания – Это буфер с высоким содержанием соли. Соль заставляет GFP изменить свою конформацию так, что гидрофобные участки оказываются снаружи.

В. Буфер для промывки – Служит для того чтобы смыть менее гидрофобные и менее прочно связанные с колонкой белки

Г. Буфер для элюции (TE) – Снимает GFP с колонки.

1. В каких буферах высокая концентрация соли, а в каких низкая? Почему должно быть именно так?

Дата добавления: 2015-08-10