Глава 7. Принципы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным

Принципы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам

В алгоритме выбора лекарственных препаратов для этиотропной терапии инфекционного процесса выделяют три основных этапа:

эмпирический выбор, осуществляемый на основании представления об этиологии патологического процесса;

коррекция выбора с учетом результатов определения резистентности к препаратам штаммов, выделенных от данного больного;

окончательный выбор, главным критерием при котором становится клиническая эффективность проводимой терапии.

Эмпирический выбор препарата базируется на сведениях о видовой чувствительности предполагаемого возбудителя и опыта этиотропной терапии данной нозологической формы. Эта информация суммирована в многочисленных справочниках и руководствах [60, 61, 87], что делает нецелесообразным ее дублирование в данном пособии. Кроме того, во внимание принимается опыт применения отдельных препаратов, накопленный в данном регионе или в конкретном лечебном учреждении, учитывающий особенности резистентности к лекарственным средствам штаммов, циркулирующих в определенной местности.

Коррективы в первоначальный выбор препаратов вносятся после выделения чистой культуры возбудителя и определения ее резистентности к набору предполагаемых к применению химиопрепаратов и бактериофагов. Следует отметить, что по ряду объективных и субъективных причин, данный этап выбора антимикробных средств на практике реализуется далеко не всегда. Среди объективных причин необходимо отметить:

некоторые микроорганизмы в подавляющем большинстве случаев сохраняют чувствительность к определенным препаратам (например, стрептококки, за исключением S.pneumoniae, всегда чувствительны к пенициллинам);

процедура определения чувствительности к антимикробным препаратам некоторых микроорганизмов (например: хламидий, риккетсий) слишком сложна, дорогостояща и длительна для практического здравоохранения.

К сожалению, результаты определения чувствительности к препаратам in vivo не всегда совпадают с клинической эффективностью данных препаратов. Возможные причины этого следующие:

приобретение микроорганизмом устойчивости к препарату в ходе лечения;

ошибка в определении этиологии процесса;

индивидуальные особенности фармакокинетики (препарат не проникает в очаг воспаления или при назначении per os не всасывается из кишечника и т.д.).

В связи с вышеизложенным, окончательная корректировка выбора препарата проводится на основании его клинической эффективности при лечении данного больного. При возникновении сомнений в эффективности препарата полезно попросить лабораторию определить его концентрацию в сыворотке крови или в моче больного.

Методы определения чувствительности бактерий к химиопрепаратам основаны на задержке роста микроорганизмов препаратом, присутствующим в ростовой среде в определенной концентрации. Минимальной ингибирующей концентрацией (МИК)[12][1] называют минимальную концентрацию препарата в питательной среде определенного состава, которая вызывает задержку роста испытуемого штамма.

Для удобства клинической интерпретации результатов определения антибиотикорезистентности по уровням МИК данного препарата все штаммы подразделяются на три категории: чувствительные Ч, умеренно-устойчивые (промежуточные) и устойчивые (табл.32).

Границы МИК, согласно которым производится подразделение бактерий на три вышеупомянутые категории устанавливаются эмпирически и носят несколько условный характер. Например, по клиническим и лабораторным стандартам США (NCCLS) и по отечественным нормативам чувствительными к гентамицину считаются штаммы с МИК £ 4 мкг/мл, а по критериям Британского общества химиотерапии - с МИК < 1 мкг/мл [58].

Таблица 32

Критерии оценки антибиотикочувствительности возбудителя инфекционной болезни [58]

Возбудитель	Характеристика
Чувствительный	Лечение данным антибиотиком будет эффективным
Промежуточный	Лечение данным антибиотиком может быть эффективным при повышенных дозах или в особых условиях
Устойчивый	Лечение данным антибиотиком не целесообразно

Набор методов, позволяющих определить чувствительность микроорганизмов к лекарственным препаратам, в настоящее время достаточно широк [74, 81]. Всех их можно подразделить на три основные группы:

диффузионные методы;

методы серийных разведений;

методы пограничных значений.

Среди диффузионных методов наиболее широкое распространение получил метод стандартных дисков. Это связано с его технологичностью и относительно невысокой себестоимостью исследований [74]. Он удобен в тех случаях, когда необходимо определить чувствительность одной культуры к нескольким антибиотикам. Для его воспроизведения на поверхность чашки сплошным газоном засевают испытуемую культуру и помещают на поверхность питательной среды диски, пропитанные растворами антибиотиков определенной концентрации. Антибиотик диффундирует в питательную среду и вызывает задержку роста культуры вокруг диска. При этом диаметр зоны задержки роста пропорционален уровню чувствительности микроорганизмов к препарату.

Воспроизводимые результаты с помощью метода стандартных дисков могут быть получены только в случае строгого выполнения всех условий постановки теста. Хотя национальные стандарты разных стран или инструкции различных производителей дисков могут отличаться (табл.33), существует ряд принципиальных моментов, оказывающих максимальное влияние на достоверность получаемого результата:

Таблица 33

Различия в ходе определения чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков согласно стандартам России и США

Этап исследования	"Инструкция по применению дисков для определения чувствительности к антибиотикам", СССР, 1984 [22]	"Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests-Sixth Edition"; Approved Standard NCCLS, USA, 1997 [84]
Питательные среды	Среда АГВ, агар на бульоне Хоттингера или МПБ	Мюллер-Хинтон агар
Приготовление чашек	Среду разливают по 20 мл в чашки диаметром 100 мм, расположенные на горизонтальной поверхности. Подсушивают 30-40 минут при комнатной температуре с приоткрытыми крышками.	Среду разливают по 25-30 мл в чашки диаметром 100 мм (слой толщиной около 4 мм). Перед использованием чашки подсушивают в термостате (35 ^оС) или в ламинарном шкафу при комнатной температуре 10-30 минут.
Подготовка инокулята	5-10 изолированных колоний 18-20 часовой агаровой культуры[13][2] суспендируют в жидкой питательной среде или в изотоническом растворе до мутности 5 ЕД по стандарту мутности НИИ им. Тарасевича (при использовании среды АГВ) или 10 ЕД (в остальных случаях). Затем суспензию разводят еще в 10 раз.	3-5 изолированных колоний суспендируют в 4-5 мл триптиказо-соевого бульона и инкубируют 2-6 часов при 35^оС пока мутность не достигнет или не превысит 0,5 ЕД по стандарту Мак-Фарданда, либо, при использоавнии 16-20 часовой культуры на неэлективной среде, непосредственно из колоний готовят суспензию 0,5 ЕД (около 2х10^8 кл./мл).
Посев	1-2 мл свежеприготовленной суспензии наносят на поверхность среды, распределяют покачиванием и удаляют избыток жидкости пипеткой. Чашку подсушивают 10-15 минут.	Через 15 минут после приготовления суспензию коттоновым тампоном наносят на поверхность среды, заштриховывая ее в двух направлениях. Чашку подсушивают 3-5 минут.
Наложение дисков	Не более 6 дисков с помощью пинцета раскладывают на расстоянии не менее 2 см от края чашки диметром 100 мм.	Не более 5 дисков наносят на чашку диаметром 100 мм на расстоянии 24 мм от центров друг друга.
Инкубация посевов	18-20 часов при 35-37 ^оС.	16-18 часов при 35 ^оС.
Отклонения в составе питательной среды. Отдельные ингредиенты питательных сред могут ингибировать активность антимикробных препаратов. Двухвалентные катионы, особенно ионы магния и кальция влияют на результаты определения чувствительности бактерий к тетрациклинам, аминогликозидам, полимиксинам. В связи с этим отечественная инструкция по применению дисков рекомендует использовать в составе питательных сред из отечественных агар-агаров "Тафуинский" агар, который характеризуется большей стандартностью содержания указанных ионов или среды АГВ [22]. Тимидин и тимин ингибируют активность сульфаниламидов и триметоприма [84]. Указанные составляющие не нормируются в отечественной среде АГВ, поэтому ее нельзя использовать для определения активности указанных препаратов. Мюллер-Хинтона агар характеризуется низким содержанием тимидина, тем не менее каждая новая партия среды должна быть проконтролирована с помощью эталонных штаммов и эталонных сульфаниламидных препаратов. При низких значениях рН снижается активность аминогликозидов и макролидов, но увеличивается активность пенициллинов, а при высоких значениях рН наоборот. Изменение условий, влияющих на диффузию препаратов в агар.Толщина слоя питательной среды, степень ее подсушивания оказывают влияние на условия диффузии антибиотиков из диска. Для получения воспроизводимых результатов очень важно разливать среду в чашки Петри с ровным дном на строго горизонтальном столе слоем,толщина которого регламентирована стандартом. Чашки должны быть правильно подсушены. После размещения дисков посевы должны быть убраны в термостат не позже, чем через 15 минут. Нарушения в режиме хранения дисков.Хранение дисков должно осуществляться при строго определенных температурных условиях. Кроме того диски следует оберегать от увлажнения, для чего упаковки снабжают поглотителем влаги и индикатором, изменение цвета которого свидетельствует о порче препарата. Согласно отечественной инструкции диски следует хранить в сухом темном месте при температуре не выше 10 ^оС. При этом вскрытый флакон должен быть использован в течение недели. После извлечения из холодильника флаконы нельзя открывать 1 час, во избежание образования конденсата на стенках. Требования американского стандарта более жесткие: хранение в холодильнике при температуре менее 8 ^оС или в морозильнике при -14 ^оС и менее. При этом b-лактамные антибиотики могут храниться только в морозильнике, из которого в холодильник переносится только недельный запас. Диски с некоторыми особо лабильными препаратами (имипенем, цефаклор, комбинации с клавуланиевой кислотой) должны извлекаться из морозильника только в день постановки опыта. Нарушения в процедуре посева.Посевная доза оказывает непосредственное влияние на диаметр зоны задержки роста вокруг диска. Поэтому прямой посев газоном без предварительного приготовления стандартной суспензии является грубым нарушением методики, ведущим к существенному искажению результатов. Ошибки при измерении диаметра зоны задержки роста.Диаметр зоны задержки роста измеряют с точностью до 1 мм. При этом игнорируются отдельные мелкие колонии в пределах зоны. В случаях не резко очерченных контуров (или зонах с двойными контурами) измеряют диаметр зоны по наиболее четкому контуру. Ошибки при интерпретации результатов.На основании диаметров зон задержек роста с помощью специальных таблиц проводят оценку степени устойчивости штаммов (чувствителен, умеренно-устойчив, устойчив). При этом следует пользоваться таблицами, предоставляемыми фирмой - производителем дисков, используемых в лаборатории, так как пограничные значения могут несколько отличаться (табл. 34).

Во избежание грубых ошибок каждая постановка опыта по определению чувствительности к антибиотикам клинических изолятов должна сопровождаться контролем, проводимым с помощью эталонных штаммов микроорганизмов. Результаты контрольных тестов фиксируют в специальном журнале.

Таблица 34

Интерпретация диаметров зон задержки роста при оценке чувствительности к цефалотину при нагрузке на диск 30 мкг

Стандарт или инструкция	D зон в мм
Устойчивые	Умеренно-устойчивые	Чувстви-тельные
DIN	< 18	19-25	> 26
NCCLS	< 14	15-17	> 18
Инструкция по…, 1986	< 11	12-16	> 17

За рубежом кроме метода дисков применяется еще один диффузионный метод - Е-тест или эпсилометрия. Для постановки Е-теста используются специальные тест-полоски, изготовленные из фильтровальной бумаги, отдельные участки которй пропитаны растворами антибиотиков разной концентрации. При помещении такой полоски на поверхность питательной среды в ней создается линейный градиент концентрации препарата, что позволяет в конечном итоге определить уровень чувствительности штамма и выразить ее в виде МИК.

Методы серийных разведений в жидкой или плотной питательной среде подразумевают посев исследуемого микроорганизма на набор питательных сред, содержащих нарастающие концентрации лекарственного препарата. Они позволяют с максимально возможной точностью определить МИК, но отличаются высокой трудоемкостью и стоимостью. К ним прибегают при проведении научных исследований, либо в тех случаях, когда определение чувствительности к антибиотикам методом дисков по какой-либо причине невозможно.

Метод пограничных значений по своей сути является разновидностью метода серийных разведений. Однако в этом случае используются питательные среды только с двумя концентрациями препарата. Первая соответствует значению пограничному между чувствительными и умеренно устойчивыми штаммами, вторая - между умеренно-устойчивыми и устойчивыми. Если испытуемый штамм не растет ни на одной из сред, то он расценивается как чувствительный к препарату, если он растет только на одной среде - как умеренно устойчивый, если рост наблюдается на двух средах - как устойчивый. Этот подход позволяет с одной стороны повысить точность определения, по сравнению с методом дисков, а с другой - снизить трудоемкость и себестоимость исследований по сравнению с методом серийных разведений. К достоинствам этого метода относятся также доступность процесса учета и интерпретации результатов, а также возможность организации промышленного выпуска необходимых диагностических препаратов.

Дата добавления: 2015-09-06