Оптимизация метода ПНР с целью информативного и экономичного выявления возбудителей НУГИ. Разработка алгоритмов использования ПНР в диагностики НУГИ

Проведенные исследования позволяют рекомендовать для использования в диагностике НУГИ у взрослых комплексное ПЦР обследование заключающееся в одновременным выявлением U.urealyticum, M.hominis, C.trachomatis, Cytomegalovirus и Herpes simplex T/II как наиболее целесообразное и эффективное. Для увеличения вероятности выделения возбудителей рекомендуется исследовать смеси субстратов, в которых возможно присутствие инфекционных агентов. У мужчин исследуется смесь соскоба клеток слизистой уретры и осадка первой утренней порции мочи, у женщин - смесь соскобов слизистых уретры, влагалища и цервикального канала. Такой подход дает возможность получить максимальную информацию при минимальной себестоимости анализа на один возбудитель.

Выделенный из смеси субстратов препарат ДНК сохраняется в лаборатории до получения результата ПЦР лечащим врачом. В случае необходимости этот материал может быть исследован на наличие других вирусов и бактерий. В частности, наряду с выявлением U.urealyticum,

M.hominis, С.trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/IT при наличии морфологических изменений эпителия слизистых необходимо исследование на папилломавирусы высокого канцерогенного риска. Тест-система «Папилломавирус-скрининг» (разработка ФГУН «ЦНИИЭ

Роспотребнадзора») является наиболее приемлемой для практических исследований. Она позволяет в одной ПЦР-реакции выявлять потенциально опасные папиломавирусы 14 генотипов, включая 6 наиболее значимых - 16, 18,31,33,35,45.

Для новорожденных, детей первых лет жизни и детей дошкольного и школьного возрастов также рекомендуется комплексное ПЦР-обследование с одновременным выявлением U.urealyticum, M.hominis, C.trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II. Исследование на данный спектр инфекционных агентов позволяет выявлять большую часть всех атипичных возбудителей, встречающихся у данного контингента.

В качестве объекта исследования мы рекомендуем использовать смесь слюны, мочи, слезного отделяемого (смыва с конъюнктивы). Использование смеси повышает эффективность детекции возбудителей. Каждый из них, по результатам наших исследований, может встречаться в любом из трех этих субстратов, в одном или нескольких. Источник выявления обусловливается формой патологии, локализацией очагов поражения и рядом других причин. Частота выявления уреаплазм, микоплазм, хламидий, вирусов группы герпеса у больных детей составляет: в слезном отделяемом 8-10%; моче 20­25%; слюне 30-37% в смеси субстратов 48-50%. Нами было показано, что разбавление в процессе смешивания трех субстратов на чувствительности метода не отражается.

Наименее инфицированным из всех субстратов является кровь, но выявление возбудителя в ней может свидетельствовать о системном характере заболевания, наличии стадии бактериемии, вириемии и состояния сепсиса. Исследование крови необходимо при длительном субфебриллитете, гепатите, гепатоспленомегапии, кардите и ряде других сходных клинических ситуаций.

Кровь исследуется отдельно на те инфекционные агенты, которые выявлены в смеси слюны, мочи, слезного отделяемого. Поскольку отбор крови у новорожденных и детей первых лет жизни процедура достаточно сложная и травмирующая, при отсутствии клинических показаний ограничиваются исследованием смеси слюны, мочи и слезного отделяемого.

Преимущество варианта с исследованием смеси субстратов заключается еще и в том, что он уменьшает вероятность ложноотрицательных результатов на 25 -30% по сравнению с проверкой только одного из них. Анализ смеси экономичнее исследования отдельных субстратов на спектр инфекционных агентов. Расход реактивов уменьшается в 2 -4 раза, продолжительность исследования сокращается в 1,5-2 раза.

На предложенный вариант комплексного обследования детей на наличие возбудителей НУГИ получен патент на изобретение «Способ выявления наиболее значимых возбудителей НУГИ (Clamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Cytomegalovirus, Herpes symplex I/II) у детей с использованием метода ПЦР».

Результаты проведенных исследований позволили определить контингента, для которых целесообразно рекомендовать комплексное ПЦР- обследование на наличие возбудителей НУГИ, а также условия и последовательность его проведения.

Контингенты: 1. Взрослые мужчины и женщины.

Семейные пары, планирующие рождение ребенка; мужчины с проблемами репродукции, воспалительными заболеваниями органов мочеполовой системы, заболеваниями опорно-двигательного аппарата; женщины планирующие беременность и беременные, женщины с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом, воспалительными заболеваниями органов мочеполовой системы, заболеваниями опорно-двигательного аппарата.

2. Дети разных возрастов.

Новорожденные от матерей, инфицированных НУГИ; новорожденные с подозрением на внутриутробное инфицирование; недоношенные дети; дети с гипотрофией, анемией, гепатоспленомегалией, гидроцефалией, энцефалопатией; часто болеющие дети; дети с инфекционно-аллергическими заболеваниями органов дыхания и опорно-двигательного аппарата; дети с дерматитами, конъюнктивитами, лимфаденитами.

Клинический материал для проведения исследования на наличие возбудителей НУГИ.

1. У мужчин исследуется смесь соскоба клеток слизистой уретры и осадка первой утренней порции мочи.

2. У женщин исследуется смесь соскобов слизистых уретры, влагалища и цервикального канала.

3. У детей при детекции возбудителей НУГИ на первом этапе рекомендуется исследование смеси субстратов, состоящей из образцов мочи, слюны, слезного отделяемого. При наличии клинических показаний и выявлении определенных инфекционных агентов в смеси субстратов проводится исследование крови на наличие этих возбудителей.

III. Ход ПЦР-обследования. Рекомендуется комплексное ПЦР обследование, позволяющее одновременно выявлять все пять ведущих возбудителей НУГИ.

Выявление в ПЦР C.trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex T/II, Papillomavirus является показанием для назначения этиотропной терапии. При обнаружении U.urealyticum и M.hominis методом ПЦР целесообразно провести микробиологическое исследование с определением концентрации микроорганизмов и их антибиотикочувствительности. При выявлении клинически значимых титров возбудителя (10⁴ КОЕ/мл и более) назначается специфическая терапия. Контроль эффективности эррадикации ранее выявленных возбудителей проводится методом ПЦР через три недели после завершения лечения.

Проведенные исследования продемонстрировали, что ПЦР является универсальным методом для первичного выявления комплекса наиболее значимых и распространенных возбудителей НУГИ. Благодаря его внедрению в практику была получена новая информация о распространенности и особенностях циркуляции труднокультивируемых форм возбудителей U.urealyticum, M.hominis, C.trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex MI среди взрослого и детского населения Нижнего Новгорода. Показана связь этих микроорганизмов с разнообразными заболеваниями, как взрослых, так и детей. Предложены экономичные алгоритм использования ПЦР в диагностике НУГИ, позволяющий эффективно и достоверно проводить обнаружение инфекционных агентов (рис. 37, 38).

ПЦР-детекция U.urealyticuym, М hominis, C.trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex l/ll в смеси соскобов слизистой уретры, влагалища, цервикального канала у женщин,в смеси соскоба слизистой уретры и осадка утренней порции мочи у мужчин.

I

Наличие положительных результатов

Щ

I

Выявлены U.urealyticuym M hominis I

Выявлены Cytomegalovirus, Herpes simplex l/ll C.trachomatis

концентрации возбудителя и его антибиотикорезистентности

I

Титр равен клинически значимому или выше

I

Титр ниже клинически значимого
	г.г':
	г
Наблюдение

Контрольное ПЦР исследов; смеси субстрато

МП

Рис.37. Алгоритм проведения диагностики НУГИ с использованием метода ПЦР у взрослых.

ПЦР - детекция U.urealyticum, М hominis, C.trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex 1/11 в смеси мочи, слюны, слезного отделяемого

i

Наличие положительных результатов

i

При необходимости выявление возбудителей в отдельных субстратах

Выявлены Cytomegalovi rus, Herpes simplex l/ll

Назначение лечения

Определение концентра! возбудителя и его антибиотикорезистентнос

Титр ниже клинически значимого

Выявлены U.urealyticuym М hominis

Наблюдение

я^щщш

Контрольное ПЦР исследование смеси субстратов

Рис.38. Алгоритм проведения диагностики НУГИ с использованием метода ПЦР у детей.

Заключение

Совершенствование методов лабораторной диагностики инфекционных заболеваний всегда являлось одним из важнейших направлений медицинской микробиологии. В настоящее время актуальной задачей является разработка и внедрение в практические исследования технологий, с высокой чувствительностью, специфичностью, производительностью. Полимеразная цепная реакция (ПЦР), основанная на выявлении уникальных фрагментов геномов возбудителей, соответствует этим требованиям и существенно расширяет возможности диагностики. Универсальность метода ПЦР и автоматизация основных этапов анализа позволяют осуществлять одновременное выявление нескольких инфекционных агентов, способных вызывать определенные типы патологии, проводить скрининговые обследования различных контингентов населения в профилактических целях. В то же время метод сложен в исполнении требует значительных материальных затрат. В связи с этим встают вопросы оптимизации метода: выбора наиболее значимых объектов исследования; создания и адаптации ПЦР тест-систем к решению проблем практической медицины; разработки оптимальных алгоритмов применения как отдельных диагностикумов, так и сочетаний нескольких тест-систем для повышения эффективности и уменьшения стоимости исследований.

В настоящей работе мы стремились системно подойти к применению ПЦР для решения практических задач диагностики социально значимых бактериальных и вирусных инфекций, позиционировать молекулярно- биологические технологии в системе диагностических исследований для наиболее рациональной и эффективной их реализации.

Для достижения поставленной цели мы на модели бактериальных ОКИ, НУГИ, хеликобактерной инфекции, парентеральных вирусных гепатитов определяли существенные аспекты и проблемы в их изучении, для решения которых необходимо применения ПЦР. Разрабатывали оптимальные алгоритмы использования метода ПЦР в диагностике этих четырех актуальных инфекционных заболеваний, позволяющие получить максимальную информацию при минимальных материальных затратах.

Бактериальные возбудители ОКИ — бактерии родов Shigella и Salmonella представляют собой классические объекты медицинской микробиологии. Они давно и успешно выявляются бактериологическим методом. Выделение и культивирование бактериальных штаммов, являются «золотым стандартом» выявления шигелл и сальмонелл. В своих исследованиях по изучению возможностей ПЦР при детекции этих микроорганизмов мы предполагали получить положительный эффект за счет уменьшения продолжительности анализа.

Несмотря на несовершенство первых ПЦР тест систем для детекции бактерий родов Shigella и Salmonella их использование позволило сократить время исследования с 5-ти до 3 дней и повысило эффективность выявления возбудителей в 2 раза по сравнению с бактериологическим методом. В диагностикумах второго поколения («Amply-Inv» и «Ампли-сенс — Salmonella species 250») была проведена существенная модернизация в комплектации, повышено качество реактивов, что увеличило надежность и технологичность систем. Повышение чувствительности позволило получать результат без подращивания исследуемых проб. Эффективность выявления бактерий родов Shigella и Salmonella тест-системами второго поколения была в 2,2-2,6 раза выше, чем бактериологическим методом, а продолжительность исследования сократилась до одного рабочего дня. Высокая специфичность и чувствительность в сочетании с надежностью и простотой позволяют рекомендовать эти диагностикумы для практических исследований.

Расширение спектра выявляемых инфекционных агентов за счет использования тест-системы на бактерий рода Campylobacter и Yersinia enterocolitica позволило проводить комплексное ПЦР-исследование одновременно на 4 основных возбудителя бактериальных ОКИ. В результате этого эффективность этиологической диагностики ОКИ увеличилась при обследовании детей на 21,6%, взрослых - на 38,6%. Себестоимость

комплексного ГГЦР исследования на 4 инфекционных агента существенно ниже себестоимости бактериологического исследования на эти возбудители. Все четыре ГГЦР тест-системы являются диагностикумами второго поколения и могут успешно использоваться практическими лабораториями.

Продемонстрированное в настоящем исследовании столь значительное преимущество ПЦР детекции бактерий родов Salmonella, Shigella над бактериологическим анализом (эффективность выявления выше в 2-3 раза), оказалось достаточно неожиданным. На наш взгляд, имеется несколько причин, определивших большую разницу в эффективности методов.

Более высокую чувствительность метода ПЦР можно объяснить ее способностью выявлять погибшие клетки, а также «некультивируемые формы» бактерий. Возможность пребывания грамотрицательных бактерий в «некультивируемом состоянии» показана относительно недавно [23, 71]. У «некультивируемых форм» бактерий резко снижена метаболическая активность, они не растут на питательных средах. Причинами перехода к некультивируемому состоянию являются неблагоприятные условия, в частности, действие антибиотиков. При исследовании клинического материала нередко часть проб отбиралась после начала антибиотикотерапии, которая могла вызвать переход бактерий в «некультивируемое состояние». В таких случаях метод ГГЦР имел заведомое преимущество перед бактериологическим исследованием. ПЦР является в настоящее время единственным надежным методом детекции подобных форм микроорганизмов. Обнаружение «некультивируемых форм» бактерий имеет важное практическое значение, так как при попадании в организм они восстанавливают вегетативную форму и вызывают заболевание.

Имеется ряд субъективных причин, влияющих на эффективность микробиологических исследований. В частности, существенное уменьшение финансирования диагностических исследований привело к снижению количества и качества анализов в практических лабораториях.

S

i

i

!

Кроме проблем ускорения исследования и повышения этиологической расшифровки ОКИ, существенным аспектом в диагностике бактериальных ОКИ является выявление штаммов имеющих факторы патогенности (токсины, факторы адгезии и инвазии). Классические методы выявления факторов патогенности крайне сложны и не позволяют исследовать значительное количество штаммов. Реальным вариантом решения задачи оказалось применение ДНК-зондов и ПЦР, выявляющих гены факторов патогенности. Этими методами нами был проведен многолетний мониторинг (1985-2005 гг.) циркуляции штаммов энтеробактерий, обладающих генами наиболее практически значимых факторов патогенности. Несмотря на существенную разницу диагностических возможностей зондов и различных вариантов тест-систем, получены непротиворечивые результаты. Для Нижегородского региона не характерна циркуляция токсигенных штаммов энтеробактерий, они регистрируются редко и быстро элиминируются. За весь период наблюдения отмечены два случая выявления штаммов, содержащих ген шигаподобного токсина 1 типа (1994 и 2003 гг.). Варианты с генами термолабильного, термостабильного, шигаподобного 2 типов не зарегистрированы. Наиболее распространенными оказались генетические детерминанты оперона инвазивности, что ожидаемо, так как они являются обязательным атрибутом бактерий рода Shigella. Гены факторов патогенности выявлялись только у шигелл и эшерихий. У представителей других изученных нами родов Enterobacteriaceae (Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Hafnia) они не обнаружены. Полученные результаты свидетельствуют, об отсутствии эффективного обмена генами факторов патогенности между энтеробактериями, хотя вероятность таких событий имеется [83]. В широких скрининговых исследованиях с целью мониторинга токсигенных штаммов нет необходимости. Целесообразно исследование на наличие генов факторов патогенности клинических изолятов этероробактерий, выделенных от больных с тяжелым течением заболевания.

Высокая степень гомологии геномных ДНК делает невозможными определение видовой принадлежности шигелл и серовариантов сальмонелл с использованием ПЦР. Несмотря на этот недостаток ПЦР экспресс-детекция на уровне родов бактерий Shigella, Salmonella, Campylobacter и на уровне вида бактерий Y. enterocolitica позволяет существенно повысить качество диагностики ОКИ. Наиболее целесообразно комплексное ПЦР обследование пациентов с подозрением на ОКИ, заключающееся в одномоментным выявлением всех четырех инфекционных агентов.

Изучение хеликобактерной инфекци и ее возбудителя Н. pylori представляло интерес по следующиму ряду причин. H.pylori открыт относительно недавно (1983 г.) и система диагностики хеликобактериоза в Российской Федерации еще не сложилась. Основные затруднения связаны с тем, что микробиологический метод выявления H.pylori доступен единичным отечественным диагностическим учреждениям. В частности, в Нижнем Новгороде за последние 16 лет, в течение которых проводилось изучение хеликобактера, ни одной из лабораторий не было освоено культивирование этих бактерий. Используемые в практической диагностике методы, основанные на микроскопии, недостаточно специфичны. В связи с этим, мы расценивали метод ПЦР как один из наиболее перспективных вариантов прямой, специфической детекции H.pylori. Кроме этого, при невозможности культивирования хеликобактера, нами ставилась задача оценить возможности ПЦР как способа изучения штаммовых особенностей этих микроорганизмов.

Метод ПЦР с высокой эффективностью выявлял H.pylori в биоптатах слизистой и желудочном соке. Желудочный сок, как субстрат с менее инвазивным получением и как более интегративный материал, рекомендован нами для исследования при детекции H.pylori. ПЦР в 2,5 раза эффективнее выявляет H.pylori, чем метод световой микроскопии отпечатков биоптатов. Наиболее близки к результатам ПЦР данные, получаемые микроскопией пристеночной слизи (браш-биопсия), но и этот вариант, как показано нами, уступает ПЦР в чувствительности.

Метод ПЦР позволил дать более объективную оценку инфицированности хеликобактером больных с гастродуоденальной патологией в Нижегородском регионе, она составила 58,9% у детей и 82,9% у взрослых. По нашему мнению высокая частота обнаружения H.pylori среди населения г. Нижнего Новгорода во многом обеспечивается за счет раннего инфицирования детей.

Для контроля эффективности противохеликобактерной терапии через 1 -2 недели после окончания курса лечения нами разработан и апробирован полуколичественный вариант ПЦР-детекции H.pylori. Анализ отдаленных последствий проведенной терапии показал, что результаты полуколичественного варианта ПЦР имеют прогностическое значение при оценке предполагаемого эффекта антихеликобактерной терапии.

Метод ПЦР (тест-система «Эритропол» фирма «Литех», г. Москва) дает возможность определить устойчивость Н. pylori к антибиотикам — макролидам. Из 97 образцов, в которых ранее выявлена ДНК Н. pylori устойчивые варианты выявлены в 3 случаях, что свидетельствует о низком уровне резистентности к макролидам штаммов Н. pylori, циркулирующих в Нижнем Новгороде.

Изучена возможность применения экспериментальных отечественных ПЦР тест-систем для выявления генов патогенности у штаммов хеликобактера. С использованием диагностикума «Диаген-Helicobacter» (фирмы «Лагис», г. Москва) установлена широкая распространенность токсигенных CagA+ штаммов H.pylori (76,4%); показано, что большая часть заболеваний желудка ассоциирована с токсигенными штаммами Н. pylori (63,4%), а при патологии двенадцатиперстной кишки чаще выявлялись CagA- отрицательные штаммы (82% от всех CagA-отрицательных изолятов);

Кроме этого, с использованием тест-системы «Хеликопол УА» (фирма «Литех», Москва) у 66% ПЦР-изолятов Н.ру1оп выявлен ген вакуолизирующего токсина УасА. Полный аллельный вариант гена установлен только у 55% УасА+ вариантов. Это связано нестабильностью работы тест-системы. Неспецифический синтез затрудняет интерпретацию результатов и использование этого диагностикума в практических исследованиях.

Методом гетеродуплексного анализа изучена возможность использования фрагмента гена CagA для определения генетического разнообразия штаммов Н.ру1оп. Показано, что фрагменты гена CagA у разных ПЦР-изолятов отличались между собой нуклеотидной последовательностью. По результатам гетеродуплексного анализа выявлено два варианта фрагментов. На наш взгляд ген Са§А является перспективным в качестве одного из возможных маркеров для изучения штаммового разнообразия Н.ру1оп.

Таким образом, за счет оптимизации и адаптации экспериментальных отечественных ПЦР тест-систем был разработан комплекс методов, дающий возможность проводить прямую, высокочувствительную, специфическую детекцию Н.ру1оп в клиническом материале, проводить оценку концентрации инфекционного агента, осуществлять ранний контроль эффективности противохеликобактерной терапии, определять устойчивость к макролидам, проводить маркирование клинических ПЦР-изолятов Н.ру1оп по наличию у них генов факторов патогенности Са§А и УасА и по степени гомологии гена Cag А. Этот комплекс методов позволяет повысить качество диагностики хеликобактерной инфекции и в значительной степени компенсировать отсутствие возможности культивирования хеликобактера в практических диагностических лабораториях.

Парентеральные вирусные гепатиты являются одной из важнейших проблем здравоохранения, и их диагностике уделяется пристальное внимание. Основная масса задач по исследованию этих инфекций успешно решается различными иммунологическими методами. При анализе возможностей метода ПЦР в диагностике парентеральных вирусных гепатитов и сопоставлении результатов ПЦР исследований и ИФА тестов на ВГС и ВГВ установлена нецелесообразность использования ПЦР при массовом первичном скрининге. Вместе с тем показано, что применение ПЦР при первичном обследовании пациентов с клиническими признаками гепатита при отсутствии белковых маркеров инфекции позволяет выявлять ВГС в период «серонегативного окна».

По данным литературы [90] основное преимущество метода ПЦР перед другими диагностическими технологиями выявления ВГС и ВГВ состоит в том, он позволяет определить активность репликации НК вирусов, оценить их концентрацию в крови, объективно охарактеризовать стадию развития заболевания и контролировать эффективность противовирусной терапии. В связи с этим, разработка варианта ПЦР для обследования больных гепатитами С и В до начала лечения и последующего контроля терапии представлялись нам одним из существенных аспектов применения ПЦР в диагностике вирусных гепатитов. Для оценки концентрации вирусов был применен метод десятикратных серийных разведений: кДНК для ВГС и ДНК, выделенной из крови (плазмы или сыворотки) - для ВГВ. Такой подход, названный нами полу количественным, оказался достаточно объективным и информативным при оценке эффективности противовирусной терапии.

Предложенный вариант ПЦР значительно дешевле исследований с применением тест-систем, использующих гибридизационно-ферментное выявление продукта амплификации и ПЦР, базирующейся на технологии «Real time». Возможно, современные технологии более точно определяют концентрацию вируса. Однако, полученные с их помощью результаты также относительны, поскольку при определении концентрации амплификация исследуемого образца сопоставляется с результатами амплификации контрольной сыворотки и при этом нет возможности сравнить уровни ингибирования реакции в пробе и контроле.

Одним из важных этапов диагностики ВГС является определение генотипа возбудителя. Эта информация имеет как научное, так и практическое значение, поскольку лечение больных, инфицированных ВГС генотипа 1Ь, отличается от терапии заболеваний, вызванных вирусами других генотипов. Использование мультиплексной системы разработки ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора позволило нам изучить особенности распространения в Нижегородском регчетырех наиболее распространенных в Евразии генотипов ВГС - 1Ь, 1а; 2; За. За период 2001-2006 гг. установлено доминирование вариантов 1Ь и За. Частота их выявления варьировала по годам и составляла 48,4-54,3% и 46,1-51,6%, соответственно. Вирусы генотипа 2 и 1а обнаруживались с невысокой частотой от 0,5 до 3,6%. С 2004 г. наметилась тенденция увеличения количества случаев инфицирования пациентов ассоциациями ВГС двух генотипов. В период 2001-2003 г.г. частота обнаружения ассоциаций не превышала 1,7% и они являлись комбинацией генотипов 1Ь и За. В 2004 г. ассоциации выявлялись в 4,6% случаев и были представлены 2 видами -1ЬЗаи1а1Ь. К 2005 году частота выявления ассоциаций разных генотипов достигла 8% и имелось уже 4 типа ассоциаций: 1Ь За; 1а 1Ь; 1Ь 2; 1а 2. Увеличение количества микст-инфекций ВГС, вероятно, связано с неоднократным инфицированием больных. Высокая частота выявления вирусов генотипа 1Ь и вероятность реинфекции ими больных, ранее заразившихся ВГС других генотипов, свидетельствует не только о необходимости определения генотипа при первичном обследовании, но и о целесообразности повторного определения генотипа в случае активизации репликации вируса на фоне успешного лечения.

Методом ПЦР изучены особенности репликации НК вирусов при различных вариантах инфицирования. При вирусных гепатитах В, С, О (моноинфекции) частота выявления вирусных НК оставляла не менее 48%. При гепатитах смешанной этиологии наблюдалось снижением интенсивности репликации вирусных НК. При микст- инфекции ВГС+ВГВ вирусные они выявлялись в 25,5%; при микст-инфекции ВГС+ВГС - 37,0%.

Такое ингибирование репликации НК возможно обусловлено явлением интерференции вирусов в клетке-хозяине. Чаще отмечалось размножение только одного из вирусов ассоциации. Случаи одновременной репликации двух вирусных НК составили максимально 19,0% от числа положительных проб при миксте ВГС+ВГО и минимально - 8,1% от числа положительных проб для пары ВГС+ВГВ. Случаев одновременной репликации НК трех вирусов не выявлено. Доминирования одного из вирусов в ассоциациях из двух или трех компонентов не установлено. Вирусные НК выявлялись, как правило, с близкими частотами. Исключение составила ассоциация ВГВ+ВПЭ. Репликация ДНК ВГВ наблюдалась в 2 раза чаще, чем репликация РНК ВГЭ. Вероятно это объясняется тем, что ВГО -сателлит ВГВ, а не самостоятельный вирус. [90]. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости при проведение контроля лечения гепатитов смешанной этиологии выявления НК всех вирусов ассоциации.

Одной из важных проблем парентеральных вирусных гепатитов является профилактика вертикального пути передачи инфекции и ранняя диагностика гепатита у новорожденных и детей первого года жизни. Проведенные нами исследования показали, что несмотря на снижение активности вирусного процесса у беременных эффективность инфицирования детей достаточно высока и составляет 10,0% для ВГС и 12,8% для ВГВ. Этот полученный нами результат в 2 раза превышает аналогичный показатель развитых стран. Обследование больных ВГС беременных женщин (104 человека) на наличие у них вирусной РНК и проведение лечения РНК позитивных пациенток снизили инфицирование новорожденных до 4,8%. Полученные результаты подтверждают необходимость проведения ПЦР-детекции РНК ВГС у женщин, имеющих белковые маркеры ВГС, в дородовый период, а у детей группы риска по ВГС - в первый месяц жизни.

Одним из возможных источников инфицирования вирусными гепатитами является контаминированная донорская кровь. На основе анализа частоты встречаемости различных вариантов вирусных нагрузок у больных хроническим ВГС за период 1997-2006 гг. нами показана недостаточная эффективность и чувствительность отечественных ПЦР тест-систем на ВГС для проверки пулов донорской крови. Вероятность выявления вируса составляет 60 - 85%. Этот показатель не позволяет рекомендовать данный вариант для практического применения.

В то же время показана высокая экономическая целесообразность ПЦР обследования на вирусные гепатиты постоянных доноров крови группы риска (повышенная активность ферментов печени). При анализе 1746 образцов крови РНК ВГС выявлена в 7,5% случаев, а ДНК ВГВ - в 2,8%. Экономический расчет показал, что стоимость лечения больных в случае минимально возможного инфицирования донорской кровью в 74 - 172 раза превысила бы стоимость данного исследования.

Таким образом, метод ПЦР в системе диагностики вирусных гепатитов наиболее востребован при исследовании больных перед лечением и для проведения контроля его эффективности. Для этой цели, может быть применен разработанный нами экономичный полуколичественный вариант ПЦР и алгоритм его использования. Кроме этого, имеется еще ряд важных проблем, решение которых не возможно без использования методов РНК- ДНК диагностики: выявление мутантных форм ВГВ, детекция ВГС в период серонегативного окна, профилактика вертикального пути передачи гепатитов, изучение гепатитов смешанной этиологии, повышение безопасности службы крови и трансплантации органов.

Наиболее сложным и масштабным этапом нашей работы были исследования НУГИ, поскольку выявление возбудителей этих инфекционных заболеваний, в Нижегородском регионе ранее осуществлялись спорадически и объективной информации о них не было. Нами проведено изучение распространенности и особенностей циркуляции наиболее значимых и важных представителей этой группы: U.urealyticum, M.hominis, C.trachomatis, Cytomegalovirus, Heipes simplex I/II. В результате было выявлено широкое распространение этих возбудителей среди взрослого населения - здоровых и бессимптомных носителей. Они обнаружены у 68% женщин и 40% мужчин, обследованных нами.

На протяжении восьмилетнего периода наблюдений сохранялось следующее распределение возбудителей по частоте их выявления: первое место занимали U.urealyticum (у женщин - 54,2%, у мужчин 30,2%); второе - M.hominis (уженщин - 25,8%, у мужчин - 14,5%) третье - Cytomegalovirus (у женщин - 10,8%) C.trachomatis (у мужчин - 6,7%); четвертое - С.trachomatis (у женщин — 8,4%), Cytomegalovirus (у мужчин - 3,0%); пятое - Herpes simplex T/II (у женщин - 2,4%, у мужчин - 1,2%).

Выявлена статистически достоверная разница в частоте выявления возбудителей НУГИ (за исключением хламидий) у женщин и мужчин. Инфицированность мужчин оказалась в 1,7 раза ниже. У женщин микоплазмы и уреаплазмы выявлялись в 1,8 раза чаще, чем у мужчин; герпес - в 2 раза; цитомегаловирус - в 3,6 раза.

При общем преобладании моноинфекций, главным образом, ассоциированных с уреаплазмами, выявлено широкое распространение ассоциаций возбудителей НУГИ. Все инфекционные агенты, кроме U.urealyticum, чаще выявлялись в ассоциациях. Никаких выраженных взаимоотношений возбудителей (симбиоз, антагонизм) не обнаружено. Вероятность выявления той или иной ассоциации определялась только частотами обнаружения составляющих ее микроорганизмов. Преобладали варианты из двух возбудителей (77,2% -у женщин, 80,0% -у мужчин) с доминированием ассоциации уреаплазма-микоплазма (45,4% - у женщин и 45,0% - у мужчин). Варианты из 3 микроорганизмов составляли 20,7 % ассоциаций у женщин и 20,0 % ассоциаций у мужчин. Смешанные инфекции, при которых обнаружены 4 или 5 возбудителей, выявлены только у женщин, их доля среди ассоциаций составила 2,1%.

Показатели частоты выявления возбудителей НУГИ у -женщин в динамике за 12 годовой период исследования изменялись следующим образом: с 1998 года 2001 наблюдался рост числа инфицированных до максимума в 2000-2001 годах. В этот период соответствующие показатели увеличились: для U.urealyticum с 43,8% до 56,5%; M.hominis с 19,2% до 31,1%; Cytomegalovirus с 9,3% до 13,8%; C.trachomatis с 7,1% до 9,9%; Herpes simplex I/II с 1,1% до 2,6%. В период 2002-2003 годы отмечалось снижение частоты выявления инфекционных агентов до уровней, близких значениям 1998г. В 2004-2005 гг. снова наметился рост, но показатели 2001 года не достигнуты. С 2006 по 2009 гг. в основном происходило уменьшение частоты выявления инфекционных агентов. Как увеличение, так и уменьшение частоты обнаружения происходило синхронно для большинства выявляемых возбудителей (рис.27). Зависимости частоты выявления возбудителей НУГИ от сезона года нами не выявлено. Средние показатели числа инфицированных за все зимние, весенние, летние и осенние сезоны по каждому из выявляемых микроорганизмов имели близкие значения.

При обследовании мужчин и женщин с воспалительными процессами в органах мочеполовой системы и женщин с ОАГА нами отмечены более высокие значения частоты выявления U.urealyticum, M.hominis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II - у женщин; U.urealyticum, M.hominis, C.trachomatis, Herpes simplex I/II — у мужчин. Наиболее ярко это проявляется при воспалительных процессах в наименее глубоких отделах урогенитального тракта: уретрите у мужчин, вагините, кольпите у женщин, а также у женщин с первичным бесплодием.

При изучении распространенности папилломавирусов в Нижегородском регионе ВПЧ с генотипами высокого канцерогенного риска 16, 18, 31, 33, 35, 45 выявлены у 28,1% обследованных, не имевших признаков изменения эпителия слизистых. В группе женщин с дисплазией и/или эрозией эпителия шейки матки онкогенные папилломавирусы выявлялись немного чаще в 32,0% случаев. Использование мультиплексной тест-системы, выявляющей 12 генотипов ВПЧ позволило в 1,5 повысить эффективность выявления папиломавирусов по сравнению с результатами, полученными за счет использования 3 диагностикумов, детектирующих 6 генотипов ВПЧ

Одной из важных проблем диагностики НУГИ является оценка эффективности проводимой терапии. Нами показано, что ПЦР позволяет проводить объективную оценку эффективности лечения. Наиболее устойчивыми к терапии оказались U. urealyticum, M.hominis. Они чаще других выявлялись при контрольных ПЦР исследованиях -. 40,2% и 23,3%, соответственно. Эта устойчивость, как было определено, связана с широким распространением антибиотикорезистентных форм этих микрорганизмов, в первую очередь, среди U.urealyticum, Поэтому в алгоритм выявления возбудителей НУГИ, базирующийся на комплексной одномоментной ПЦР детекции U.urealyticum, M.hominis, C.trachomatis, Cytomegalovirus, Heipes simplex I/II, при выявлении U. urealyticum, M.hominis, вводится этап микробиологического исследования, одной из целей которого является определение антибиотикорезистентности этих бактерий.

Одним из важнейших аспектов НУГИ является их влияние на развитие беременности и плода. Инфекционные агенты из данной группы могут в случае реализации вертикального пути передачи вызывать различные патологические процессы у детей. Сравнение частот выявления возбудителей НУГИ у беременных женщин и новорожденных показало высокую вероятность передачи возбудителей НУГИ от инфицированных матерей новорожденным внутриутробно и во время родов: 44,3% для U.urealyticum; 58,5% для M.hominis; 39,3% для C.trachomatis; 55,6% для Cytomegalovirus; 16,7% для Herpes simplex I/II. Сходные результаты получены при обследовании 60 пар мать-ребенок, у них в 46% случаев выявлены одинаковые инфекционные агенты, преимущественно микоплазмы и цитомегаловирусы.

Анализ распространенности возбудителей НУГИ у детей разных возрастных групп позволил установить этапы колонизации макроорганизма вирусами группы герпеса и бактериями представителями родов Mycoplasma и Ureaplasma.

Цитомегаловирус и вирус герпеса простого обнаруживаются у новорожденных в 5,8% и 0,4% случаев, соответственно, что свидетельствует о том, что вертикальный путь передачи не является ведущим при инфицировании человека этими инфекционными агентами. В дальнейшем частота их выявления резко возрастает. Активная колонизация организма вирусами группы герпеса происходит в первые месяцы и годы жизни за счет других путей передачи (контактно-бытового,воздушно-капельного) и к 2-х летнему возрасту до 65% детей уже инфицированы цитомегаловирусом и до 8% - вирусом герпеса простого. С учетом того, что герпесвирусы могут длительное время пребывать в латентной форме, не размножаясь, показатели истинной инфицированности, по-видимому, еще выше.

От 23 до 31%) новорожденных инфицируются U.urealyticum внутриутробно и в процессе родов. Однако, по-видимому, в большинстве случаев уреаплазмы не вызывают заболеваний и элиминируются из организма. У детей старше года и до 13 лет частота выявления уреаплазм меньше, чем у новорожденных и составляет 4-8%. Большая часть человеческой популяции колонизируется U.urealyticum, начиная с 14-ти летнего возраста в период полового созревания и активной репродукции, в основном, за счет полового пути передачи. Частота выявления U.urealyticum в данный период у здоровых людей и бессимптомных носителей может превышать 50%.

Частота инфицирования детей M.hominis внутриутробно и при родах составляет 12 — 15%. Частота их выявления стабильно поддерживается на этом уровне до 13-ти летнего возраста. Второй этап колонизации макроорганизма так же, как и в случае с U.urealyticum, начинается с 14-ти лет и связан с половым путем передачи. Частота выявления M.hominis у здоровых людей в этот период достигает 25%.

Высокая частота выявления U.urealyticum и М. hominis у здоровых людей свидетельствует о том, что проникновение этих бактерий в организм человека не всегда приводит к развитию заболевания. При инфицировании может происходить формирование своеобразного компонента общего микробиоценоза человека — микробиоценоза мембран клеток слизистых оболочек.

Развитие заболеваний, обусловленных микоплазмами и уреаплазмами, зачастую вызывается не внешним инфицированием, а представляет собой сбой в микробиоценозе, приводящий к нарушению нормального взаимодействия макроорганизма и микроорганизма. По-видимому, это обусловлено нарушениями функционирования иммунной системы. Наряду с инфекционным агентом при воспалительных процессах, ассоциированных с уреаплазмами и микоплазмами, обнаруживаются аутоиммунные процессы. При одновременном обследование 38 больных женщин на возбудители НУГИ и антитела к нативной ДНК, кардиолипину, миоглобину, хорианическому гонадотропному гормону (исследование, совместное с лабораторией иммунохимии Нижегородского НИИЭМ), нами у всех инфицированных уреаплазмами и микоплазмами выявлено повышенное содержание аутоантител к одному или нескольким маркерам. Максимальные концетрации аутоантител и наибольшее разнообразие их сочетаний отмечено для больных с ассоциацией уреаплазма — микоплазма. У пациентов, инфицированных C.trachomatis, аутоиммунные процессы не выявлены. Данные об изменении функционирования иммунной системы при уреаплазмозах и микоплазмозах получены также рядом зарубежных и отечественных исследовательских групп [2, 22, 87, 196, 215, 368].

Из двух представителей семейства Molicuta наиболее потенциально опасными представляются бактерии M.hominis. На основании анализа акушерско-гинекологического анамнеза и результатов ПЦР нами в ряде случаев установлена связь этого инфекционного агента с внутриутробной гибелью плода. На первых этапах изучения НУГИ, когда практические врачи не уделяли должного внимания уреаплазм и микоплазм и не проводили лечения инфицированных ими беременных, M.hominis выявлялись в секционном материале от мертворожденных и умерших новорожденных чаще других возбудителей НУГИ.

Вирусы группы герпеса достаточно редко выявлялись у взрослых. Существенно чаще они обнаруживались у детей первых лет жизни. Они были ассоциированы с самыми различными патологическими процессами и заболеваниями, но достаточно часто ЦМВ и ВПГ1/П выявлялись и у детей без клинических признаков. Вирусы обнаруживались в основном в слюне и моче. В крови они выявлялись в 10 раз реже, чем в этих субстратах. Многие практические врачи склонны видеть опасность только при выявлении герпесвирусов в крови и обращают мало внимания на случаи, когда вирус находится в слюне и моче. Считаем, что нельзя недооценивать выявление цитомегаловируса и герпеса простого в других биологических жидкостях помимо крови. Поскольку репликация данных вирусов в организме человека независимо от субстрата выделения свидетельствует об иммунодефиците.

C.trachomatis, по нашим наблюдениям, соответствовал статусу патогенного микроорганизма. Этот инфекционный агент при попадании в организм взрослых и детей вызывал патологический процесс с определенными клиническими симптомами. Бессимптомное носительство и хронизация процесса выявлялись нами для C.trachomatis редко. При лечении хламидиоза в большинстве случаев наблюдалось выздоровление с эррадикацией возбудителя.

В диагностике НУГИ наиболее эффективно и целесообразно использование комплексного ПЦР обследования больных и контингентов риска, заключающееся в одномоментном выявлении пяти наиболее важных возбудителей (U.urealyticum, M.hominis, C.trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II) в смеси субстатов, в которых наиболее вероятно присутствие инфекционных агентов. Нами разработаны алгоритмы использования ПЦП при диагностике НУГИ взрослых и детей

На основании результатов проведенных исследований можно сделать вывод о том, ПЦР может рассматриваться как один из базовых методов в диагностике НУГИ и хеликобактерной инфекции и как метод первичного скрининга для выявления бактериальных возбудителей ОКИ. Метод ПЦР не целесообразен в качестве стартового этапа обследования пациентов с подозрением на парентеральные вирусные гепатиты. По стоимости и информативности препочтительнее тесты на НВБ-антиген для ВГВ и тесты на антитела для ВГС. Но ПЦР - единственным методов, который позволяет выявлять ВГС в период «серонегативного окна», обнаруживать мутантные по НВз-антигену формы ВГВ, регистрировать репликацию вирусных НК, объективно исследовать гепатиты смешанной этиологии, контролировать эффективность противовирусной терапии, проводить раннее выявление ВГВ и ВГС у детей, группы риска, определять генотипы вирусов гепатита.

Большая часть исследований проводились нами в режиме сопровождения лечебного процесса. ПЦР-детекция этиологических агентов позволила своевременно назначать и проводить эффективную антибактериальную и иммуномодулирующую терапию, сократить сроки пребывания больного в стационаре, сроки реабилитации и снизить риск возникновения осложнений. Все разработки непосредственно апробировались и внедрялись в практическую диагностику НУГИ, ОКИ, вирусных гепатитов, хеликобактерной инфекции и способствовали ее совершенствованию.

Наиболее объективные результаты получаются при ПЦР диагностике тех заболеваний, при которых инфекционные агенты выходят в биологические жидкости организма (кровь, мочу, слюну, слезное отделяемое) или локализуются на кожных и слизистых покровах. При диссеминации инфекции и очаговой локализации возбудителя ПЦР диагностика не эффективна.

Повышение эффективности выявления инфекционных агентов, уменьшение продолжительности и себестоимости анализа достигается одновременным анализом пула (смеси) субстратов, в которых вероятно присутствие наиболее значимых для данной патологии возбудителей.

Использование в современных ПЦР тест-системах с электрофоретическим выявлением ампликона внутреннего контрольного образца, антиконтаминационной модификации ампликонов и разработка тест-систем с флюоресцентной детекцией ампликона (технологии PCR-Real time и PCR-End point) значительно снизили вероятность контаминации и получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Но все эти совершенствования затрагивают только стадии ПЦР и детекции продукта амплификации. Как показывает практика, наибольший риск перекрестной контаминации, вызывающей ложноположительные результаты и возможность потери и порчи субстратов, приводящие к ложноотрицательным результатам, связаны со стадиями отбора, хранения и транспортировки материалов. Перекрестная контаминация возможна также и на стадии подготовки материала к ПЦР. Ввести объективный контроль этих стадий сложно, их успех, главным образом, определяет квалификация исполнителя.

Разработанные в ходе выполнения данной работы алгоритмы диагностики НУГИ, ОКИ, парентеральных вирусных гепатитов, хеликобактерной инфекции с применением метода ПЦР могут быть использованы в дальнейшем при подготовке новых диагностических стандартов. Предложенные перечни инфекционных агентов для комплексной диагностики НУГИ и ОКИ могут служить основой для комплектации мультиплексных ПЦР-тест систем с детекцией продуктов амплификации методом биочипов.

Учитывая опыт использования институтом молекулярно- биологических методов, и на основании исследований, проводимых при выполнении данной диссертационной работы на базе Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии в соответствии с приказом №2 от 03.01.1995 г. Государственного комитета санитарно-эпидемиологического надзора Российской Федерации был сформирован первый в Волго-Вятском регионе многопрофильный ПЦР диагностический центр (Волго-Вятский региональный научно-практический центр по индикации, идентификации и таксономии микроорганизмов и организации противоэпидемической работы в экстремальных условиях). Основу деятельности центра составили направления нашей работы: выявление возбудителей НУГИ, ОКИ, хеликобактериоза, вирусных гепатитов. При проведении диагностических исследований используется комплексный подход, заключающийся в одновременном выявлении наиболее значимых возбудителей заболеваний. Разработанные алгоритмы диагностики инфекционных заболеваний и модификации технологий непосредственно после апробации внедряются в работу центра.

В настоящее время в Нижегородском регионе наиболее востребованными аспектами в работе центра являются: ч

-по диагностике НУГИ - обследование семейных пар, планирующих рождение ребенка, взрослых с проблемами репродукции и воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, детей с подозрением на ВУИ, секционного материала от мертворожденных и умерших новорожденных. У данного контингента проводится выявление U.urealyticum, M.hominis, C.trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II, дополнительно проводится исследование на M.genitalium, T.gondii, папилломавирусы высокого канцерогенного риска;

- по диагностике ОКИ - исследование материала от больных с подозрением на ОКИ, анализ продуктов питания и смывов с объектов внешней среды при расследовании случаев вспышечной и спорадической заболеваемости. При этом, как правило, проводится одновременное выявление бактерий родов Salmonella, Shigella, Campylobacter и Yersinia enterocolitica; -по диагностике хеликобактерной инфекции — обследование больных с гастродуоденальной патологией на наличие H.pylori до и после лечения; определение устойчивости H.pylori к макролидам;

в диагностике вирусных гепатитов — контроль эффективности противовирусной терапии, раннее выявление инфицирования вирусами гепатитов В и С детей, рожденных больными матерями, контроль постоянных доноров, выявление вирусов гепатитов G и TTV у детей больных лейкозами.

На основании запросов органов практического здравоохранения сформировался ряд новых направлений. Наиболее важные среди них:

- выявление возбудителей воспалительных заболеваний органов дыхания. При этом исследовании проводится детекция как труднокультивируемых форм (M.pneumoniae, С.pneumoniae, C.psittaci), так и традиционных инфекционных агентов (S.pneumoniae, H.influenzae). Эффективность выявления срептококка и хемофилла методом ПЦР в 1,5-2 раза выше, чем бактериологическим методом;

- выявление возбудителей гнойных и серозных менингитов. Проводится комплексное исследование ликвора на бактериальные и вирусные инфекционные агенты: S.pneumoniae, H.influenzae, N.meningitidis, эетеровирусы, герпес простой и цитомегаловирус;

- обследование часто болеющих детей и детей с полилимфоаденопатиями на наличие активной репликации вирусов группы герпеса (цитомегаловирус, герпес простой, вирус Эпштейн-Барр, герпес тип 6).

В 90-е годы основными задачами центра являлись популяризация и внедрение в практику молекулярно биологических методов диагностики, подготовка специалистов и оказание методической помощи при организации ПЦР лабораторий в лечебных учреждениях и учреждениях санэпиднадзора. В настоящее время в условиях, когда работает множество лабораторий, использующих метод ПЦР, на первое место выходит референс функция (объективная оценка качества диагностики), а также проведение наиболее сложных и требующих высокой квалификации исследований при оперативном решении проблем, возникающих при диагностике инфекционных заболеваний в Нижегородском регионе.

Многопрофильность центра позволяет максимально эффективно использовать имеющуюся материальную базу, быстро и гибко реагировать на изменяющуюся ситуацию (осваивать новые объекты и направления). В настоящее время имеется возможность выявления возбудителей более 30 нозологических форм в режиме сопровождения лечебного процесса, а не ретроспективного исследования.

При участии и методической помощи Центра были организованы ПЦР лаборатории в Нижегородском НИИ детской гастроэнтерологии, Нижегородском областном диагностическом центре, Нижегородском областном центре переливания крови, Нижегородском областном кожно- венерологическом диспансере, инфекционной больнице №2 Нижнего Новгорода, кожно-венерологическом диспансере Сормовского района Нижнего Новгорода и в целом ряде коммерческих медицинских организаций.

260 Выводы.

1. Научно обоснованы и разработаны оптимальные алгоритмы использования метода ПЦР для диагностики бактериальных ОКИ, хеликобактерной инфекции, парентеральных вирусных гепатитов и НУГИ на основе метода ПЦР. Показано, что диагностическая и экономическая эффективность выявления возбудителей повышается за счет одновременной ПЦР-детекции наиболее значимых патогенов в смеси информативных субстратов.

2. Разработка комплекса собственных тестов и использование экспериментальных отечественных ПЦР тест-систем позволили провести мониторинг клинических изолятов семейства Enterobacteriacea на наличие генов токсигенности, инвазивности за длительный период времени и определить особенности циркуляции таких штаммов. Использование скрининговых ПЦР-тестов для первичного обследования больных с подозрением на ОКИ более чем в 2 раза увеличило эффективность выявления основных возбудителей бактериальных ОКИ - бактерий родов Shigella и Salmonella по сравнению с классическим микробиологическим методом.

3. Выявлена высокая эффективность колонизации макроорганизма Н. pylori, начинающаяся с первых лет жизни; установлены высокие показатели частоты выявления хеликобактера как у детей, так и у взрослых с различными формами гастродуоденальной патологии. Показано широкое распространение генов токсигенности cagA и vakA среди клинических изолятов Н. pylori. Предложен экономичный полуколичественный вариант ПЦР-детекции Н. pylori, позволяющий контролировать эффективность антихеликобактерной терапии и прогнозировать отдаленные результаты лечения.

4. Установлено, что на территории Нижнего Новгорода и Нижегородской области, на протяжении 6 лет (2000 - 2006 гг.) доминируют генотипы ВГС lb и За, имеется тенденция к увеличению количества случаев инфицирования пациентов ВГС двух генотипов. Установлена высокая частота (10%) передачи ВГС внутриутробно и при родах. Показано, что возбудители вирусных гепатитов менее активно реплицируются при смешанном инфицировании (ВГВ+ВГС; ВГС+ВГО; ВГВ+ВГ0; ВГВ+BrC+BrG), по сравнению с моноинфекцией. Выраженного доминирования одного из вирусов над другим при микстинфекциях не установлено.

5. Показано широкое распространение возбудителей НУГИ (40-68%) среди взрослого населения как здоровых, так и больных с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта. Характерно широкое распространение ассоциаций этих микроорганизмов. За 12-ти летний период наблюдений распространенность инфекционных агентов сохранялась на высоком уровне, неизменными оставались средние показатели частоты выявления определенных видов микрооргнизмов по годам и сезонам.

6. Установлены возрастные этапы колонизации макроорганизма возбудителями НУГИ: для вирусов группы герпеса характерно инфицирование макроорганизма в первые годы жизни воздушно-капельным и контактно-бытовым путями передачи; частота выявления U. urealyticum резко возрастает в период полового созревания с преимущественным половым путем передачи инфекционного агента, для М. hominis показаны два этапа колонизации: первый происходит внутриутробно и/или в процессе родов, второй этап - в период полового созревания преимущественно половым путем.

7. Высокая частота выявления U. urealyticum и М. hominis у здоровых людей свидетельствует о том, что попадание этих бактерий в организм человека, как правило, не вызывает развитие заболевания, а приводит к формированию компонента общего микробиоценоза человека — микробиоценоза мембран.

Список источников литературы.

1. Анализ генома. Методы / Сб. ст. под ред. К. Дейвиса. - М.: Изд-во Мир, 1990. - 247 с.

2. Антропова Н.Е. Состояние иммунного гомеостаза у женщин с бесплодием при урогенитальных инфекциях / Н.Е. Антропова // Генодиагностика инфекционных болезней. - Москва, 2004. - Т. 1. - С. 6-7.

3. Анчукова Э.Л. Возможности цитологической диагностики Helicobacter pylori по материалу гастробиопсий / Э.Л. Анчукова // Клиническая лабораторная диагностика. — 1992, № 11-12. - С. 66-68.

4. Аруин. Л.И. Хронический гастрит / Л.И.Аруин, П.Я. Григорьев, В.А. Исаков и др. // Амстердам. — 1993. - С. 151-161.

5. Афанасьев А.Ю. ИФА-диагностика в разграничении гепатита С острого и хронического течения / А.Ю. Афанасьев, С.В. Зубов, Ю.Е. Жданов и др. // Росс, журнал гастроэнтерол., гепатол. и колопроктол. — 1995. - Т. 5, № 3. - (Прилож. 1). - С. 12.

6. Батурин В.В. Использование метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот для экспресс-дагностики гриппа / В.В. Батурин // Вопросы вирусологии. - 1985. - Т. 30, № 5. - С. 540-544.

7. Белохвостов А.С. Полимеразная цепная реакция и лигазные реакции, принципы, традиционные методики и нововведения / А.С. Белохвостов // Молекулярноя генетика, микробиология, вирусология. - 1995. - № 2. - С. 21­25.

8. Блохина И.Н. Систематика бактерий (с основами геносистематики. / И.Н. Блохина, Г.Ф. Леванова, А.С. Антонов. - Нижний Новгород.: Б.и., 1992. - 170 с.

9. Блохина И.Н. Первичная структура ДНК и прикладная геносистематика бактерий с основами молекулярной эпидемиологии / И.Н. Блохина, Г.Ф. Леванова, В.Н. Мазепа // Материалы 2 съезда биохимического общества РАН. - Пущино, 1997. - С.101.

10. Богданова Т.А. Иммунологическая реактивность детей, больных бронхиальной астмой, отягощенной цитомегаловирусной и микоплазменной инфекциями / Т.А. Богданова, Н.И. Кубышева, А.В Максимова и др. // Здоровье населения Нижегородской области. Итоги региональной программы. - Н. Новгород, 2002. - С. 101-106.

11. Борхсениус С.Н. Микоплазмы / С.Н. Борхсениус, О.А. Чернова, В.М. Чернов и др. - СПб.: Наука, 2002. - 352 с.

12. Водопьянов С.О. Опыт ПЦР-диагностики в практике врача акушера- гинеколога / С.О. Водопьянов, М.Ю. Карагичев, А.С. Водопьянов // Генодиагностика инфекционных болезней. - Москва, 2004.- Т. 1. - С. 13-15.

13. Волков А.И. Хронические гастродуодениты и язвенная болезнь у детей / А.И. Волков // Рус. Мед. Журнал. - 1999. - Т. 7, № 4. - С. 4-20.

14. Газизулин Р.Ю. Сравнительная оценка распространенности ИППП в Ижевске / Р.Ю. Газизулин. JI.A. Гаврилова // Генодиагностика инфекционных болезней. - Москва, 2004. - Т. 1. - С. 22-24.

15. Глазкова JI.K. Практические аспекты персистирующей хламидийной инфекции / Л.К. Глазкова, О.Е. Акимов // ИППП. - 1999, № 4. - С. 29-34.

16. Говорун В.М. Молекулярная диагностика и генотипирование Helicobacter pylori в биопсиях слизистой оболочки желудка / В.М.Говорун, А.Е. Гущин, В.А. Исаков // Росс, журнал гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2000. - № 2. - С. 12-15.

17. Гранитов В.Н. Герпесвирусная инфекция. / В.Н.Гранитов. - М.: Мед. Книга, 2001.-80 с.

18. Гранитов В.Н. Хламидиозы./В.Н.Гранитов. - М.: Мед. Книга, 2000.-192 с.

19. Грановский Н.Н. Обнаружение ДЕК вируса гепатита В методом молекулярной гибридизации у HBs-антигеноносителей и больных анемиями. / Н.Н.Грановский // Вопросы вирусологии. - 1986. - Т.31, № 4. - С. 449-451.

20. Громыко А.И. Эпидемия заболеваний, передаваемых половым путем в странах Восточной Европы / А.И. Громыко // 3111111. - 1996, № 6. - С. 22-25.

21. Дмитриев Г.А. Современные методы диагностики наиболее распространенных инфекций, передаваемых половым путем / Г.А. Дмитриев // Consilium medicum. - Дерматология, венерология. - 2002. - №4. - С. 256-259.

22. Долгих Т.И. ПЦР-диагностика папиломавирусной инфекции у женщин репродуктивного возраста / Т.И. Долгих, Н.А. Михайлова, Т.Г. Гордиенко //Генодиагностика инфекционных болезней.-Москва, 2004. - Т. 1. - С. 29-31.

23. Домарадский И.В. Некоторые проблемы адаптации патогенных бактерий к окружающей среде / И.В. Домарадский // Журн. микробиол. — 1997. - №4. - С. 29-34.

24. Дубинина И.Г. Метод полимеразной цепной реакции в лабораторной практике / И.Г. Дубинина, С.Н. Щербо, В.Б. Макаров // Клиническая лабораторная диагностика. - 1997. - № 7. - С. 4-6.

25. Евсюкова И.И. Актуальные проблемы клиники, диагностики и лечения хламидийной инфекции у новорожденных детей / И.И Евсюкова, Е.Н. Патрушева, A.M. Савичева и др. //Акушерство и гинекология. - 1995. - №1. - С. 25-36.

26. Зазимко JI.A. Выявление острой цитомегаловирусной инфекции у беременных женщин и новорожденных / J1.A. Зазимко, А.В. Кузенкова // Тез. докл форума «Человек и лекарство». - Москва, 1996. С. 120.

27. Ивашкин В.Т. Helicobacter pylori и язвенная болезнь / В.Т. Ивашкин // Клиническая фармакология и терапия. - 1997. - Т. 6, № 1. - С. 34-37.

28. Ивашкин В.Т. Основы лазерного ¹³С-уреазного дыхательного теста и практика клинического применения// В.Т. Ивашкин, Е.И. Никитина, Е.В. Степанов и др. // Сб. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. Под ред. В.Т Ивашкина, Ф. Мегро, T.J1. Лапиной. - М.: Триада-Х, 1999. - С. 122­130.

29. Ивашков Е.А. Динамика повозрастной частоты выявления возбудителей ИППП у женщин Хабаровска на протяжении 1998-2003 гг./Е.А.Ивашков, О.В. Ивашкова// Генодиагностика инфекционных болезней. - Москва, 2004. -

Т. 1. - С. 39-43.

30. Ивашков Е.А.Мониторинг частоты обнаружения урогенитальных инфекций у женщин Хабаровска на протяжении 1998-2003 гг. / Е.А.Ивашков // Генодиагностика инфекционных болезней. - Москва, 2004. - Т. 1. - С. 43­45.

31. Исаков В.А. Герпес. Патогенез и лабораторная диагностика / В.А. Исаков, В.В. Борисова, Д.В. Исаков. - СПб.: 1999.- 190 с.

32. Каргальцева Н.М. Хеликобактериоз. Методическое пособие. Санкт- Петербургская академия постдипломного образования / Н.М. Каргальцева. - СПб.: 1997. - 12 с.

33. Катышева А.В. Значение эрадикации Helicobacter pylori при ранней реабилитации больных после ушивания перфоративных гастродуоденальных язв / Ф.В. Катышева, С.С. Белоусов, М.А.Махова // Росс, журнал гастроэнтерол., гепатол., колопроктол.- 2001. - Т. 11, № 2. - С. 44-46.

34. Кишкун А.А. Современные методы диагностики и оценки эффективности лечения инфекции, вызванной Helicobacter pylori / А.А. Кишкун // Клин. лаб. диагностика. - 2002. - № 8. - С. 41-46.

35. Козлова В.И. Вирусные, хламидийные, микоплазменные заболевания гениталий. Руководство для врачей. 6-е изд., обновл. и доп. /В.И Козлова, А.Ф. Пухнер. -М.: Триада-Х, 2003. - 438 с.

36. Корсунский А.А. Инфекция Helicobacter pylori в педиатрической практике / А.А. Корсунский // Сб. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. Под ред. В.Т. Ивашкина, Ф. Мегро, T.JI. Лапиной. - М.: Триада-Х, 1999. - С. 224-242.

37. Красько А.Г. Диагностика ротавирусной инфекции человека методом точечной гибридизации. / А.Г.Красько // Вопросы вирусологии.-1987.-Т.32, №2.-С. 208-213.

38. Кудрявцева Л.В., Мисюрина О.Ю., Генерозов Э.В. и др. Клиника, диагностика и лечение хламидийной инфекции. Пособие для врачей / Л.В. Кудрявцева, О.Ю. Мисюрина, Генерозов О.В. -М.: 2003, 60 с.

39. Лапина Т.Л. Основные принципы диагностики Helicobacter pylori. / Т.Л.Лапина// Сб. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. Под ред. В.Т. Ивашкина, Ф. Мегро, Т.Л. Лапиной. - М.: Триада-Х, 1999. - С. 107­116.

40. Леванова Г.Ф. Молекулярно-биологические способы идентификации и дифференциации бактерий. Методические рекомендации / Г.Ф. Леванова, О.В. Парфенова, С.Ю. Кашников. -М.: 1995. - 19 с.

41. Логинов А.С. Язвенная болезнь и Helicobacter pylori. Новые аспекты патогенетической терапии / А.С. Логинов, Л.И. Аруин, А.А.Ильченко. - М.: 1993.-С. 9-25.

42. Мавров И.И. Нарушение репродуктивной функции у больных урогенитальным хламидиозом и уреаплазмозом // Вестник дерматологии. - 1992.-№11.-С. 72-75.

43. Мазепа В.Н. Метод ПЦР диагностики в обследовании новорожденных и детей первого года жизни при риске внутриутробного инфицирования. Методические рекомендации / В.Н. Мазепа, Н.Ф. Бруснигина, О.М. Черневская и др. - Н. Новгород: 2000.- 15 с.

44. Мазепа В.Н. Опыт использования ПЦР-диагностики в санитарно- эпидемиологической практике / В.Н. Мазепа, Н.Ф. Бруснигина, О.М.Черневская и др. // Материалы межрегиональной научно-практической конференции "Экология и здоровье".- Н. Новгород, 1998. - С. 18.

45. Мазепа В.Н. Опыт работы центра индикации, идентификации и таксономии Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной. / В.Н. Мазепа, Н.Ф. Бруснигина, О.М. Черневская и др //Материалы международной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицинской биотехнологии», посвященной памяти академика РАМН И.Н. Блохиной.- Москва, 2000. - С. 64.

' 46. Маниатис Т. Молекулярное клонирование / Т.Маниатис, Э. Фрич, Д.

j Сэмбрук, - М.: Мир, 1984. - 480 с.

I

I

/

47. Маркова Г.А. Применение ПЦР для идентификации Helicobacter pylori в клиническом материале / Г.А. Маркова, Р.Х. Бошнаков, П.К. Петров // Молек. генетика, микробиол и вирусол. - 1994. - № 1. - С. 10-15.

48. Медицинская лабораторная диагностика. Программы алгоритмы. / Под ред. А.И. Карпищенко. - СПб.: Интермедика, 1997. - 296 с.

49. Медицинские и лабораторные технологии. Справочник. Т.2. / Под ред. А.И. Карпищенко. - СПб.: Интермедика, 1999. - 654с.

Дата добавления: 2015-07-20