Место ПЦР в общей системе методов диагностики НУГИ.

На первой стадии исследования проведено сопоставление метода ПЦР с другими технологиями диагностики НУГИ, которые преимущественно используются практическими лабораториями. Оказалось, что для выявления каждой из групп возбудителей НУГИ, анализируемых нами, используются свои методы.

Наиболее распространенным вариантом детекции C.trachomatis является выявление хламидийного антигена ПИФ, он введен в стандарты диагностики хламидиозов в Российской Федерации. Достоинствами ПИФ являются экспрессность, простота, относительная дешевизна. Нами сопоставлены результаты выявления C.trachomatis методами ПИФ и ПЦР полученные при обследовании пациенток 5 женской консультации Нижнего Новгорода. Частота обнаружения хламидий у женщин по результатам ПЦР исследований составила 7,5±1,0%, что сопоставимо с данными литературы (7-15%) [35]. Методом ПИФ хламидии выявлены в 30±1,7% случаев (п=730). В ряде других практических лабораторий Нижнего Новгорода частота выявления С^гасЬотаЙБ методом ПИФ достигает 60-80%. Полученные данные заставляют усомниться в такой распространенности хламидий. При проверке одних и тех же образцов пробы положительные в ПИФ часто оказываются отрицательными в ПЦР.

На наш взгляд причиной гипердиагностики ПИФ может являться как недостаточная специфичность тест-систем, так и субъективность - результат устанавливается просмотром мазка под микроскопом, приборная фиксация изображения не производится. Ложноположительные результаты возможны также при недостаточной обработке многократно используемых предметных стекол.

Достаточно широко используются в практике ИФА диагностикумы для выявления антител к С.1:гас1ютаШ. Чаще применяются тест-системы на суммарные антитела и антитела класса ^О. Выявление антител класса ^М затруднено перекрестными реакциями с ревматоидным фактором. По нашему мнению постановка диагноза «хламидиоз» на основании однократного выявления антител даже в высоких титрах неправомерна. Для получения достоверных результатов необходимо изучение этого показателя в динамике и проведение двух - трех исследований в парных сыворотках. При наличии роста титра антител, целесообразно провести выявление возбудителя, поскольку возможны перекрестные реакции с другими видам хламидий и других микроорганизмов.

Однако, в ряде случаев метод динамического исследования парных сывороток на антитела к СМтасИотаЙБ является единственным вариантом получения информации. Примером могут являться очаговые хламидиозы, при которых возбудитель не выходит в биологические жидкости и отсутствует возможность прицельного отбора инфицированного материала на исследование.

Культуральный метод выявления хламидий, считающийся «золотым стандартом», из-за сложности, трудоемкости и дороговизны на практике применяется редко. В Нижнем Новгороде нет лабораторий, использующих этот метод.

В настоящее время ПНР является наиболее привлекательным из методов прямой первичной диагностики заболеваний, вызываемых C.trachomatis. Этот вариант имеет высокую специфичность, чувствительность, высокопроизводителен, непродолжителен. Несмотря на относительно высокую стоимость, он активно внедряется в практику. В странах Европы и США он наряду с культивированием рассматривается как «золотой стандарт» диагностики хламидиозов.

M.hominis и U.urealyticum, в отличие от C.trachomatis, способны расти на сложных питательных средах, поэтому наиболее распространенным вариантом их выявления является микробиологический анализ. За рубежом индикация М. hominis и U. Urealyticum успешно проводится с помощью жидких дифференциально-диагностических сред и планшетных микробиологических тест-систем на основе дегидратированных вариантов этих сред [И]. Аналоги таких диагностикумов с недавнего времени производятся в Российской Федерации.

Нами проведены параллельные испытания отечественных жидких питательных сред: производства ООО «Диагност» (г. Омск), и экспериментальных сред разработки Московской медицинской академии им. М.И.Сеченова и методом и сравнение их с ПЦР.

Омские среды позволяют определить концентрацию возбудителя в условных цветоизменяющих единицах. Однако, проводить оценку результатов посева визуально сложно из-за неудачного цветового перехода индикатора (со слабо зеленого на желтый). Кроме этого, выявлены низкие ростовые свойства среды, поскольку только у 40±4,5% из 120 положительных в ПЦР проб выявлен рост микроорганизмов. По этой причине среда оценена нами как непригодная для практической диагностики.

Экспериментальная среда Московской медицинской академии им. М.И.Сеченова имела ряд преимуществ по сравнению со средой ООО «Диагност»: использован более контрастный цветовой переход индикатора - с желтого на красный при росте уреаплазм и с желтого на малиновый для микоплазм. Концентрация возбудителя оценивается в колониеобразующих единицах (КОЕ) на миллилитр. Использование экспериментальной среды позволило определять антибиотикорезистентность М.Ьотнш и и.игеа1у!лсит. Для 85±3,3% из 120 положительных в ПЦР проб, отмечен рост на экспериментальных средах. Эффективность выявления М.Ьогштз и и.игеа1у1;юит на средах Московской медицинской академии им. М.И.Сеченова достоверно выше, чем на средах ООО «Диагност» (1 > 2,6).

Чувствительность микробиологического теста в большей степени, чем ПЦР, зависит от соблюдения условий отбора, хранения и транспортировки материала, так как микроорганизм погибает быстрее, чем разрушаются его нуклеиновые кислоты. Повысить эффективность выявления уреаплазм и микоплазм можно, если посев проводить непосредственно у постели больного.

Таким образом, установлена более высокая эффективность ПЦР детекции микоплазм и уреаплазм по сравнению с микробиологическим методом - на 15%. Однако, микробиологический анализ с использованием экспериментальных питательных сред более информативный, поскольку он позволяет определить этиологически значимую концентрацию возбудителя и спектр его антибиотикочувствительности. С нашей точки зрения, более целесообразно использовать ПЦР для первичного выявления М.Ьогшшб, и.игеа]у11сит. При получении положительного результата в ПЦР мы рекомендуем проведение последующего микробиологического исследования с целью определения концентрации инфекционного агента и его чувствительности к антибактериальным препаратам.

ИФА тест-системы для выявления антигенов цитомегаловируса и вируса герпеса простого I и II типов используются достаточно редко, что не позволило нам сравнить их с ПЦР тест-системами. Наиболее распространенным в практике тестом на ЦМВ и ВПГ I/II является выявление специфичных к ним антител классов IgG и IgM методом ИФА. Антитела класса IgG к этим вирусам выявляются у 90-95% людей без симптомов заболевания. Титр антител не всегда соответствует выраженности клинических симптомов заболевания. Часто здоровые люди и бессимптомные носители имеют высокие титры антител, а пациенты с выраженной симптоматикой - низкие. Антитела класса IgM не всегда являются показателем первичной инфекции, так как могут циркулировать в крови в течение нескольких месяцев или лет, что связано с нарушением иммунитета у лиц, инфицированных вирусами группы герпеса [17,31,35]. У пациентов с иммунодефицитами различной природы, антитела класса IgM к ЦМВ и ВПГ I и II типов вообще могут не выявляться. Так, из 122 детей первого года жизни с комплексной патологией (поражения центральной нервной системы, дыхательной системы, печени, селезенки), подозрением на внутриутробное инфицирование и выявленной нами методом ПЦР ДНК ЦМВ, только у 18 (14,8±3,3) наблюдался нормальный иммунный ответ с синтезом антител обоих классов. В то же время у детей (п = 164), направленных на исследование по причине обнаружения у них антител к ЦМВ и ВПГ I/II в высоких титрах, ДНК выявлялась не более чем в 40,2±3,8% случаев. Таким образом, серологические тесты на антитела к цитомегаловирусу и вирусу герпеса простого I и II типов не могут служить единственным и надежным критерием при постановке диагноза.

ПЦР тест-системы на Cytomegalovirus и Herpes simplex I/II выявляют ДНК этих вирусов в период их активной репликации. В это время вирус обнаруживается в слюне, моче и реже в крови. В латентный период, когда вирусы сохраняются в клетках нервных ганглий, они не выявляются в биологических жидкостях организма методом ПЦР. Таким образом, положительный результат ПЦР свидетельствует не только о присутствии ЦМВ или ВГТГ I/II, но и об их активизации в макроорганизме. На основании данных литературы [17, 26, 31] и результатов собственных исследований можно сделать вывод о том, что метод ПЦР является наиболее информативным и объективным тестом при диагностике герпесвирусных инфекций.

Проведенные сравнительные исследования позволяют рекомендовать метод ПЦР как основной первичный тест для диагностики НУГИ. Он единственный из изученных методов, который позволяет проводить одновременное выявление всего комплекса наиболее распространенных и значимых возбудителей НУГИ.

Дата добавления: 2015-07-20