Глава III. Результаты и обсуждение

III.1.Оценка функциональной активности фагоцитов крови пациентов с ХСН II-III функциональных классов по NYHA на примере образования активных форм кислорода при действии Формил-метионил-лейцил-фенилаланина (FMLP) и Форбол-12-миристат-13-ацетата (РМА)

Исходное состояние фагоцитов и выраженность ответа на такие стандартные агенты, как РМА и FMLP, является важной характеристикой воспалительного процесса и прогноза заболевания в целом. В качестве критерия степени клеточной активации может служить уровень образования активных форма кислорода. Для его измерения использовался метод люцигенин-зависимой хемилюминесценции. При измерении базального уровня LC- зависимой ХЛ на крови пациентов с ХСН II-III функционального класса по NYHA наблюдалось спонтанное монотонное увеличение уровня радикалов кислорода во времени (см.Рис.11) Рисунок 11. Влияние РМА и FMLP на базальный уровень образования радикалов кислорода в образцах цельной крови пациентов с ХСН II-III функционального класса по NYHA. Примечание: по оси абсцисс-время (1 деление - 8сек); по оси ординат – хемилюминесценция в имп/сек. РМА – 1мкМ, FMLP - 3мкМ. Это связано с наличием в крови таких пациентов фагоцитов в предактивированном (праймированном) состоянии. Такой рост интенсивности ХЛ-реакции является результатом адгезии к пластиковой поверхности кюветы праймированных фагоцитов. Для активации дыхательного взрыва в пробу крови с люцигенином добавляли стандартный агент - РМА конечной концентрации 1мкМ, в результате чего ответ многократно усиливался (см.Рис.10).Относительное увеличение этого показателя варьировалось в пределах от 1,4 до 6,1 раз. При добавлении в эту же пробу FMLP конечной концентрации 3мкМ наблюдалось продолжение роста интенсивности ХЛ, то есть уровень радикалов кислорода продолжал увеличиваться (см.Рис.11). При изменении последовательности добавок эффект FMLP наступал медленнее. Это обусловлено механизмом действия бактериального трипептида (cм.Рис.12).

Рисунок 12. Влияние FMLP и РМА на базальный уровень образования радикалов кислорода в образцах цельной крови пациентов с ХСН II-III функционального класса по NYHA. Примечание: по оси абсцисс-время (1 деление - 8сек); по оси ординат – хемилюминесценция в имп/сек. FMLP - 3мкМ, РМА – 1мкМ. Известно, что FMLP действует через рецепторы на плазматической мембране клеток, поэтому для проявления его активности необходимо больше времени. Тогда как РМА напрямую активирует все изоформы протеинкиназы С (РКС), в результате чего вызывает более мощное и быстрое образование АФК, в несколько раз превышающее образование радикалов кислорода при действии FMLP. В связи с этим, в качестве наиболее оптимального индуктора дыхательного взрыва был выбран форболовый эфир (РМА).Стоит также отметить, что, как и уровень базальной ХЛ, так и ответы на стандартные агенты, отличаются у разных пациентов и условно их можно разделить на три группы: с низким, умеренным и выраженным ответами (См.Приложение 1). Низкий уровень ответа, вероятно, связан со снижением функциональной активности фагоцитов, дезактивацией или истощением НАДФН-оксидазного ферментативного комплекса. На столь низких ответах изучать биологическую активность препаратов не представляется возможным (cм.Рис.13).

Рисунок 13. Влияние РМА и FMLP на базальный уровень образования радикалов кислорода в образцах цельной крови пациентов с ХСН II-III функционального класса по NYHA. Примечание: по оси абсцисс-время (1 деление - 8сек); по оси ординат – хемилюминесценция в имп/сек. РМА – 1мкМ, FMLP - 3мкМ.

Однако, в большинстве случаев наблюдался выраженный ответ на добавление в пробу активирующих агентов (См.Рис.10,11). Вероятно, что повышенная активность фагоцитов крови связана с их праймированным состоянием. Такое неконтролируемое образование АФК опасно для окружающих клеток и тканей и может приводить к серьезным повреждениям. Таким образом, кровь пациентов с ХСН II-III функционального класса по NYHA является удобной моделью для изучения биологической активности препаратов, в том числе их способности влиять на уровень образования радикалов кислорода фагоцитами крови, так как при действии стандартных агентов-индукторов дыхательного взрыва на праймированные фагоциты, возможно получить ответы со схожей кинетикой хемилюминесцентных реакций у разных пациентов.

III.2. Определение оптимальных доз Актовегина и Зифодины, вызывающих максимальный биологический ответ на Форбол-12-миристат-13-ацетат (РМА)

Для изучения комбинированного действия препаратов Актовегина и Зифодина предварительно было необходимо определить оптимальную концентрацию, вызывающую максимальное снижение уровня радикалов кислорода на фоне действия форболового эфира (РМА). Определение оптимальной концентрации производили в каждом отдельном случае. В пробу цельной крови (100мкл) пациентов с ХСН II-III функционального класса по NYHA добавляли активатор ХЛ – люцигенин (30 мкМ) и измеряли базальный уровень ХЛ. Для активации дыхательного взрыва добавляли стандартный агент РМА (1 мкМ). На максимуме ответа на РМА в пробу последовательно вносили сначала 4мг, затем 8 мг и 10 мг Актовегина и измеряли интенсивность ХЛ-реакции. Добавление Актовегина концентрационно-зависимым образом приводило к снижению уровня радикалов кислорода.

Рисунок 14. Влияние разных доз Актовегина (АКТ) на образование радикалов кислорода, индуцированное форболовым эфиром (РМА), в образцах цельной крови пациентов с ХСН II-III функционального классов по NYHA. Примечание: по оси абсцисс-время (1 деление - 8сек); по оси ординат – хемилюминесценция в имп/сек. РМА- 1мкМ.

На рисунке 14 представлен типичный график концентрационной зависимости ингибиторных эффектов Актовегина. В дозе 4мг Актовегин снижал уровень интенсивности ХЛ на 9 %. Однако, это значение не является достоверным. В дозах 8мг и 10 мг Актовегин достоверно снижал интенсивность ХЛ реакции на 36%, последующее добавление 10 мг препарата не вызывало эффекта и уровень интенсивность ХЛ соответствовал таковому при добавлении 8 мг Актовегина. Максимальный ответ наблюдался при добавлении Актовегина в средней дозе 8 мг. В среднем Актовегин снижал уровень ХЛ в дозе 4 мг на 9,3 %, что не являлось достоверным значением; в дозе 8 мг достоверно снижал интенсивность ХЛ на 40,3%, добавление 10 мг препарата не вызывало дополнительного эффекта (cм.Рис.15).

**

**

*

Рисунок 15. Ингибиторный эффект различных концентраций Актовегина на фоне действия РМА в пробе цельной крови пациентов с ХСН II-III функционального класса по NYHA. Примечание: по оси ординат - %, за 100 % принят эффект РМА; по оси абсцисс: 1- эффект действия РМА (1мкМ); 2- РМА (1 мкМ) + Актовегин (4 мг); 3- РМА (1 мкМ) + Актовегин (8 мг); 4- РМА (1 мкМ) + Актовегин (10мг).*-отсутствие достоверного (р>0,05) различия по сравнению с действием РМА; **-наличие достоверного (р≤0,01) различия по сравнению с действием РМА.n=7

Рисунок 16. Влияние разных доз Зифодина (ЗИФ) на образование радикалов кислорода, индуцированное форболовым эфиром (РМА), в образцах цельной крови пациентов с ХСН II-III функционального классов по NYHA. Примечание: по оси абсцисс-время (1 деление - 8сек); по оси ординат – хемилюминесценция в имп/сек. РМА- 1мкМ.

Аналогичным образом определяли оптимальную дозу препарата Зифодин. На максимуме ответа на РМА добавляли последовательно в пробу цельной крови (100мкл) с люцигенином конечной концентрации 30 мкМ Зифодин в дозах 4 мг, 8 мг и 10 мг. На рисунке 16 представлен типичный график, отражающий влияние разных доз Зифодина на уровень интенсивности ХЛ. Зифодин в дозе 4 мг снижал уровень интенсивности ХЛ на 19%, но эти данные не достоверны. В дозе 8 мг Зифодин достоверно снижал интенсивность ХЛ на 32 %, последующее добавление в пробу 10 мг препарата не вызывало изменений. В среднем Зифодин на максимуме ответа на РМА снижал уровень ХЛ в дозе 4 мг на 8 %, что не являлось достоверным значением; в дозе 8 мг достоверно снижал интенсивность ХЛ реакции на 38,6%, добавление 10 мг препарата не вызывало дополнительного эффекта (cм.Рис.17).

**

**

*

Рисунок 17. Ингибиторный эффект различных концентраций Зифодина на фоне действия РМА в пробе цельной крови пациентов с ХСН II-III функционального класса по NYHA. Примечание: по оси ординат - %, за 100 % принят эффект РМА; по оси абсцисс: 1- эффект действия РМА (1мкМ); 2- РМА (1 мКМ) + Зифодин (4 мг); 3- РМА (1 мКМ) + Зифодин (8 мг); 4- РМА (1 мКМ) + Зифодин (10мг). *-отсутствие достоверного (р>0,05) различия по сравнению с действием РМА; **-наличие достоверного (р≤0,01) различия по сравнению с действием РМА.n=7

Максимальное снижение уровня радикалов кислорода было зарегистрировано при добавлении Зифодина в средней дозе равной 8 мг. Таким образом, среднее значение доз, вызывающих максимальный биологический ответ, и для Актовегина, и для Зифодина, составило 8 мг.

III.3.Изучение комбинированного действия препаратов Актовегина и Зифодина на крови пациентов с ХСН II-III функциональных классов по NYHA на примере образования активных форм кислорода при действии Формил-метионил-лейцил-фенилаланина (FMLP) и Форбол-12-миристат-13-ацетата (РМА)

РМА 1мкМ

После определения доз, вызывающих максимальный биологический ответ, которые для Актовегина и Зифодина составили в среднем 8 мг, представилось возможным изучить их комбинированное действие. В пробу цельной крови добавляли активатор ХЛ - люцигенин (30 мкМ) и измеряли базальный уровень ХЛ. Далее добавляли стандартный агент- форболовый эфир – РМА (1мкМ) – мощный индуктор дыхательного взрыва. На максимуме ответа на форболовый эфир добавляли Актовегин в оптимальной дозе 8 мг. На рисунке 18 показан типичный график комбинированного действия оптимальных доз Актовегина и Зифодина. Актовегин достоверно выраженным образом снижал уровень радикалов кислорода на 20,3 % в дозе 8 мг.

Рисунок 18. Комбинированное действие препаратов Актовегина (АКТ) и Зифодина (ЗИФ) на образование радикалов кислорода, индуцированное форболовым эфиром (РМА), в пробе цельной крови пациентов с ХСН II-III функционального класса по NYHA. Примечание: по оси абсцисс-время (1 деление - 8сек); по оси ординат – хемилюминесценция в имп/сек. РМА- 1мкМ.

В эту же пробу добавляли Зифодин в дозе 8 мг. В результате совместного присутствия в пробе 8 мг Актовегина и 8мг Зифодина уровень ХЛ достоверно снижался до59,5%. В среднем добавление 8 мг Актовегина к пробе цельной крови (100мкл) с люцигенином (30мкМ) на максимуме ответа на действие РМА (1мкМ) регистрировалось достоверное снижение уровня интенсивности ХЛ на 27,5%. При внесении в пробу 8мг Зифодина интенсивность ХЛ достоверно снижалась до 57,5 % в сравнении со 100%-ым эффектом РМА (cм.Рис.19).

**

**

Рисунок 19. Комбинированное действие препаратов Актовегина и Зифодина в дозах, вызывающих максимальных эффект, на фоне действия РМА на крови пациентов с ХСН II-III функционального класса по NYHA. Примечание: по оси ординат - %, за 100 % принят эффект РМА; по оси абсцисс: 1- эффект действия РМА (1мкМ); 2- РМА (1 мкМ) + Актовегин (8 мг); 3- РМА (1 мкМ) + Зифодин (8 мг). **-наличие достоверного (р≤0,01) различия по сравнению с действием РМА.n=7

При изменении последовательности добавок наблюдался аналогичный результат. При добавлении 8мг Зифодина в пробу цельной крови (100мкл) с люцигенином (30мкМ) на максимуме ответа на РМА(1мкМ) уровень радикалов кислорода достоверно снижался на 24 % (cм.Рис.20). При последующем внесении в пробу 8 мг Актовегина интенсивность ХЛ снижалась дополнительно до 57% по сравнению со 100%-ым эффектом РМА.

Рисунок 20. Комбинированное действие препаратов Зифодина (ЗИФ) и Актовегина (АКТ) на образование радикалов кислорода, индуцированное форболовым эфиром (РМА), в пробе цельной крови пациентов с ХСН II-III функционального класса по NYHA. Примечание: по оси абсцисс-время (1 деление - 8сек); по оси ординат – хемилюминесценция в имп/сек. РМА- 1мкМ.

В среднем при добавлении 8 мг Зифодина к пробе крови с Актовегином регистрировалось достоверное снижение уровня интенсивности ХЛ до 69,5%% по сравнению со 100%-ым эффектом РМА. При внесении в пробу 8мг Зифодина интенсивность ХЛ дополнительно снижалась до 52,5% (cм.Рис.21).

**

**

Рисунок 21. Комбинированное действие препаратов Зифодина и Актовегина в дозах, вызывающих максимальных эффект,на оне действия РМА на крови пациентов с ХСН II-III функционального класса по NYHA. Примечание: по оси ординат - %, за 100 % принят эффект РМА; по оси абсцисс: 1- эффект действия РМА (1мкМ); 2- РМА (1 мкМ) + Зифодин(8 мг); 3- РМА (1 мкМ) + Актовегин (8 мг). **-наличие достоверного (р≤0,01) различия по сравнению с действием РМА.n=8 При комбинации препаратов Актовегина и Зифодина в дозах, вызывающих максимальный эффект, был зарегистрирован аддитивный эффект. Из этого следует, что вероятно препараты действуют по разным механизмам. На основании полученных результатов возможно предположить, что оригинальный препарат Актовегин и его дженерик-Зифодин не тождественны по составу и в препарате - дженерике содержится дополнительный компонент/или компоненты, что и лежит в основе аддитивного эффекта.

ВЫВОДЫ

1. Для пациентов с хронической сердечной недостаточностью II-III функциональных классов по NYHA характерно наличие в крови фагоцитов в предактивированном (праймированном) состоянии. Об этом свидетельствует спонтанное монотонное увеличение уровня образования радикалов кислорода во времени в результате адгезии фагоцитов к пластиковой стенке кюветы.

Добавление к пробе цельной крови (100мкл) с люцигенином (30 мкм) Форбол-12-миристат-13-ацетата (РМА) (1мкМ) сопровождалось выраженным увеличением уровня образования радикалов кислорода и ростом интенсивности хемилюминесценции. В связи с этим, кровь таких пациентов являлась удобным объектом для изучения биологической активности препаратов, в частности их способности влиять на уровень образования радикалов кислорода, генерируемых фагоцитами крови.

2. Наиболее оптимальным и высокочувствительным (не менее 10⁵ квант/с при времени счета 10 сек) методом определения уровня образования радикалов кислорода является метод хемилюминесценции.

3. Актовегин и Зифодин выраженным концентрационно-зависимым образом снижали уровень радикалов кислород. Среднее значение доз, вызывающих максимальный биологический ответ, и для Актовегина, и для Зифодина, составило 8 мг.

В дозе 8 мг Актовегин снижал уровень интенсивности хемилюминесценции на 32,5% по сравнению со 100%-ым эффектом РМА, Зифодин в дозе 8 мг- на 31%. 4. При последовательном добавлении Актовегина (8 мг) и Зифодина (8 мг) в пробу цельной крови наблюдался аддитивный эффект.

На фоне действия Форбол-12-миристат-13-ацетата (РМА) (1мкМ) Актовегин и Зифодин снижали уровень радикалов кислорода на 42,5%. При изменении последовательности добавок - на 47,5%, что превышало эффекты действия каждого из препаратов отдельно.

На основании полученных результатов можно предположить, что препараты Актовегин и Зифодин действуют по разным механизмам, а, следовательно, отличаются по составу, что и лежит в основе аддитивного эффекта.

Дата добавления: 2015-07-15