Методы исследования. Микроскопическое исследование соскоба из уретры подразумевает микроскопию мазков

Микроскопическое исследование соскоба из уретры подразумевает микроскопию мазков, окрашенных по Граму и метиленовым синим. Микроскопия окрашенных препаратов в первую очередь направлена на диагностику гонореи и трихомониаза. При её проведении следует руководствоваться методическими указаниями "Лабораторная диагностика гонореи и трихомониаза", утвержденными приказом МЗ СССР №1570 от 4 декабря 1986 [48]. При микроскопии мазка оценивают и отражают в ответе количество форменных элементов и слизи (большое, умеренное, незначительное, скудное количество, единичные клетки), лейкоцитов (0-3, 5-10, 15-20, покрывают все поле зрения и т.д.,). Указывают наличие бактериальной флоры, отмечая морфологический тип и отношение к окраске по Граму, и особо подчеркивают присутствие или отсутствие Neisseria gonorrhoeae и Trichomonas vaginalis

Гонококки - грамотрицательные диплококки, имеющие форму кофейного зерна и обращенные друг к другу свой вогнутой стороной. Внутри лейкоцитов располагаются парами или группами, под различными углами друг к другу. Внеклеточные гонококки часто располагаются в виде скоплений. Положительный ответ выдается только в случае обнаружения типичных гонококков, одновременно в мазках окрашенном метиленовым синим и по Граму.

Трихомонады в мазках окрашенных по Граму и метиленовым синим, имеют овальную или грушевидную форму, с хорошо очерченными контурами и нежно-ячеистым строением цитоплазмы. Ядро расположено эксцентрично и интенсивно окрашено. Для изучения более тонкого строения трихомонад используют окраску по Романовскому-Гимзе.

Очень ценным, но из-за организационных сложностей не всегда используемым методом диагностики трихомониаза является микроскопия нативного препарата. В этом случае на слегка подогретое предметное стекло наносят каплю изотонического раствора, в котором и суспендируют исследуемый материал. Препарат покрывают покровным стеклом и немедленно микроскопируют с объективом х40 и окуляром х10. Предпочтительным является использование фазово-контрастного или темнопольного микроскопов. Признаками трихомонад в этом случае являются: грушевидная или овальная форма; размер, чуть больше лейкоцита; характерная толчкообразная подвижность и наличие жгутиков.

Следует отметить, что все виды микроскопического исследования при исследовании материала из мужских половых органов, несмотря на кажущеюся техническую доступность, требуют очень высокой квалификации исполнителя. Потому микроскопическое исследование должен проводить только врач-лаборант, прошедший специальную подготовку.

При культуральном исследовании отделяемого из уретры могут быть обнаружены как патогенные микроорганизмы (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis), так и условно-патогенные (микоплазмы, энтеробактерии, стафилококки, стрептококки и др.). Для обнаружения условно-патогенных микроорганизмов производится посев исследуемого материала тампоном на кровяной агар, с последующим выделением чистой культуры и их идентификацией. С помощью такого посева невозможно обнаружить гонококки, трихомонады, хламидии, уреаплазмы и микоплазмы. Для обнаружения этих микроорганизмов нужны специальные методы.

При бактериологической диагностике гонореи руководствуются в первую очередь методическими указаниями "Лабораторная диагностика гонореи и трихомониаза"[48]. Этот документ допускает использование для диагностики гонореи асцит-агар и ряда безасцитных сред с сывороткой крупного рогатого скота, приготовленных на основе мясопептонного агара из мяса кролика. Эти среды не стойки при хранении, поэтому должны изготавливаться непосредственно в лаборатории, что неудобно. В связи с этим в стране был налажен выпуск сухой двухкомпонентной коммерческой среды - "Питательная среда для выделения гонококков, сухая". Эта среда состоит из основы и специальной обогащающей добавки, легка в приготовлении и достаточно эффективна. Вне зависимости от вида используемой питательной среды инкубацию посевов проводят при 37 ^оС в атмосфере, обогащенной углекислым газом (20%) в течение 1-2 суток. Если среда не зарастает сопутствующей флорой, а рост гонококков отсутствует, желательно пролонгировать инкубацию до 8 суток с ежедневным просмотром посевов.

В настоящее время на отечественном рынке имеется ряд зарубежных сред для выделения гонококков. Так фирма BioMerieux (Франция) поставляет готовую к применению культуральную систему “Gonoline DUO”, представляющую собой прозрачный цилиндрический контейнер с крышкой, в которой закреплена пластинка с двумя агаровыми средами. Посев осуществляется при помощи тампона, после чего на дно контейнера помещается специальная таблетка, выполняющая функцию СО₂-генератора, и контейнер плотно закрывается. Данная система очень удобна, однако основной ее недостаток – ограниченный срок годности, существенно затрудняет ее применение.

Другой группой патогенов, для выделения которых необходимы специальные среды, являются микоплазмы. К группе так называемых «генитальных» микоплазм относятся Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium и Ureaplasma urealyticum. M.genitalium трудно культивируется и, как правило, культурально не выявляется. Для выделения из исследуемого материала M.hominis и U.urealyticum разработан ряд питательных сред, которые могут быть приготовлены в лаборатории. Основу сред составляют высококачественные пептоны и перевары, например, перевар сердечной мышцы, плацентарный бульон, триптиказно-соевый бульон. В их состав входят также различные факторы роста, среди которых важнейшими являются лошадиная сыворотка, как источник липопротеидов и холестерина, необходимых для синтеза цитоплазматической мембраны, дрожжевой экстракт, обеспечивающий потребности данной группы микроорганизмов в витаминах и предшественниках нуклеиновых кислот и цистеин, снижающий окислительно-восста­но­ви­тель­ный потенциал среды. Поскольку в практических лабораториях субкультивирование микоплазм не проводят, среды для первичного выделения обладают дифференциальными свойствами. Для идентификации M.hominis в качестве дифференцирующего фактора используют аргинин, а для U.urealyticum – мочевину. Продукция аммиака при утилизации субстрата приводит к сдвигу рН среды в щелочную сторону и срабатыванию индикатора (обычно – феноловый красный, реже – бромтимоловый синий). В плотных средах в качестве дифференцирующего фактора применяется сульфат марганца, восстановление которого до оксида вызывает окрашивание колоний уреаплазм в коричнево-черный цвет. Для подавления роста сопутствующей бактериальной и грибковой флоры применяются различные смеси антибиотиков.

Технология приготовления этих сред подробно описана в методических рекомендациях «Лабораторная диагностика микоплазмоза у людей» [33] и «Урогенитальные хламидиоз, уреаплазмоз, гарднереллез (диагностика, лечение, профилактика)» [62]. Их изготовление возможно только в крупных специализированных лабораториях. Кроме того, внутрилабораторный контроль ростовых свойств этих сред практически не возможен, что существенно сказывается на стандартности проводимых исследований.

Рисунок 2 Диагностическая система "Mycoplasma IST"

Стандартные высококачественные среды и тест-системы для микоплазм и уреаплазм выпускаются ведущими микробиологическими фирмами. В качестве примера приведем описание системы “Mycoplasma IST” (BioMerieux, Франция). Она состоит из уреа-аргининового бульона, выполняющего одновременно функцию транспортной среды, и 16-луночной панели, позволяющей идентифицировать микроорганизм (M.hominis или U.urealyticum), определить диагностическую значимость изолята (> 10⁴ кл./мл или < 10⁴ кл./мл) и чувствительность к шести антибиотикам по двум контрольным точкам. Аналогичные характеристики имеет тест-система “Mycoplasma DUO” + “S.I.R. Mycoplasma” (Sanofi Diagnostics Pasteur, Франция). Ее отличительной особенностью является то, что идентификация и полуколичественный учет микроорганизмов осуществляются в тест-системе “Mycoplasma DUO”, а для определения чувствительности выделенной культуры к антибиотикам (8 препаратов по двум контрольным точкам) при необходимости используется панель “S.I.R. Mycoplasma”.

Диагностический набор “Mycoplasma LYO” (BioMerieux, Франция) содержит уреа-аргининовый бульон и компоненты, необходимые для приготовления модифицированного агара А7. Материал забирается в бульон и при температуре +4-8 ⁰С может храниться до 48 часов. Количественный посев осуществляют, нанося 3 капли по 20 мкл на поверхность среды А7 в чашках Петри диаметром 55-60 мм. После впитывания жидкости посевы инкубируют в анаэробных или микроаэрофильных условиях 48 часов. Учет роста на агаре проводят при малом увеличении микроскопа. Колонии M.hominis размером 100 – 300 мкм имеют плотный оформленный центр и тонкую нежную периферическую зону («яичница-глазунья»), колонии уреаплазм более мелкие, без периферической зоны, окрашены в темно-коричневый цвет (MnO₂). Использование этой питательной среды, при соблюдении рекомендованной фирмой техники посева, также позволяет ориентировочно определить концентрацию микоплазм в исследуемом материале (табл.11).

Таблица 11

Определение концентрации микоплазм и уреаплазм при посеве на плотную среду

Количество колоний в поле зрения (объектив х10)	Концентрация микроорганизмов, КОЕ/мл
<1	10^3
1-5	10^4
5-15	10^5
>15	10^6

Chlamydia trachomatis – один из наиболее значимых микроорганизмов в современной структуре заболеваний, передающихся половым путем, относится к облигатным внутриклеточным паразитам. Для выделения этого возбудителя необходимо использование техники клеточных культур, что исключает этот метод диагностики для большинства лабораторий. В то же время, этот метод при использовании клеток McCoy является одним из самых чувствительных и единственным, позволяющим определить чувствительность C.trachomatis к антибиотикам, что особенно важно, учитывая появление антибиотико-резистентных штаммов урогенитальных сероваров.

В последние годы при диагностике урогенитальный инфекций широкое распространение получили некультуральные методы: реакция иммунофлюоресценции, полимеразная цепная реакция и другие.

Для постановки реакции иммунофлюоресценции могут быть использованы диагностические наборы, как отечественного, так и импортного производства (табл. 12). Техника постановки реакции подробно описана в прилагаемых к наборам руководствах, а общие принципы применения - в главе 6.

Полимеразная цепная реакция находит все более широкое применение в практических лабораториях благодаря своей высокой чувствительности и технологичности. Принцип метода описан в главе 6, здесь же ограничимся перечнем инфекций, для диагностики которых с помощью ПЦР имеются отечественные коммерческие системы (табл. 13).

Для экспресс-диагностики хламидийной инфекции разработан ряд тест-систем для прямого обнаружения антигенов возбудителя в пробе. В основу некоторых из них положен принцип иммунохроматографии, описанный в главе 6. Такие системы на рынок предлагают фирмы "Clearview" [Великобритания], "Inotech International" [Франция], "Дива" [Россия] и некоторые другие. Достоинством этих систем является простота постановки теста, но по чувствительности и специфичности они несколько уступают культуральному методу и ПЦР.

Таблица 12

Некоторые коммерческие наборы для диагностики урогенитальный инфекций в РИФ

Микроорганизм	Название набора	Фирма-изготовитель
Chlamydia trachomatis	«Хламоноскрин»	СП Ниармедик, Москва
«ХламиСлайд»	НПФ «ЛАБдиагностика», Москва
«Chlamyset»	Orion Diagnostic, Финляндия
«MicroTrack»	Syva, США
«ХламиСкан-2»	АО «Союзагромед», Москва
Mycoplasma hominis	«Микогомо Флюоскрин»	СП Ниармедик, Москва
«МикоСлайд»	НПФ «ЛАБдиагностика», Москва
Ureaplasma urealyticum	«Уреагени Флюоскрин»	СП Ниармедик, Москва
«УреаСлайд»	НПФ «ЛАБдиагностика», Москва
Trichomonas vaginalis	«ТрихоСлайд»	НПФ «ЛАБдиагностика», Москва
Gardnerella vaginalis	«ВагиСлайд»	НПФ «ЛАБдиагностика», Москва

Таблица 13

Некоторые коммерческие наборы для диагностики урогенитальных инфекций в ПЦР

Микроорганизм	Название набора	Фирма-изготовитель
Chlamydia trachomatis	«Amplicor C.trachomatis»	Hoffman-LaRoshe, Швейцария
«ПОЛИМИК Хламидия»	НПФ «ЛИТЕХ», Москва
«ХламАм»	АОЗТ «ВСМ», Москва
Mycoplasma hominis	«МикАм»	АОЗТ «ВСМ», Москва
«ПОЛИМИК Микоплазма»	НПФ «ЛИТЕХ», Москва
Mycoplasma genitalium	«МикгАм»	АОЗТ «Внедрение систем в медицину», Москва
Ureaplasma urealyticum	«УреАм»	АОЗТ «Внедрение систем в медицину», Москва
«ПОЛИМИК Уреаплазма»	НПФ «ЛИТЕХ», Москва
Neisseria gonorrhoeae	«ГонАм»	АОЗТ «Внедрение систем в медицину», Москва
«Amplicor N.gonorrhoeae»	Hoffman-LaRoshe, Швейцария

Дата добавления: 2015-09-06