Глава 2. Принципы микробиологического исследования отдельных видов материала от больных и

Принципы микробиологического исследования отдельных видов материала от больных и интерпретации результатов

Кровь

Показания к проведению исследования: клиническая картина сепсиса; лихорадочные состояния неустановленной этиологии; подозрение на инфекционные заболевания: брюшной тиф и паратифы, сальмонеллезы, бруцеллез, возвратный тиф, лептоспирозы, малярия, эпидемический менингит, пневмококковые инфекции, пищевые токсикоинфекции (при наличии лихорадки), стафилококковые и стрептококковые инфекции, сибирская язва, туляремия, чума.

Взятие исследуемого материала: взятие крови целесообразно осуществлять во время лихорадочного периода, до начала химиотерапии или через 12-24 часа после последнего введения препарата. Манипуляции проводят с соблюдением правил асептики. Используют стерильные 20-граммовые (для детей 10-граммовые) шприцы с иглами для венопункции или одноразовые системы для взятия крови. При отсутствии централизованной стерилизационной шприцы, иглы с мандренами кипятят 45 минут в отдельном дезинфекционном кипятильнике. По окончанию обработки воду сливают, дают инструментам остыть, не открывая кипятильника, и собирают шприц стерильным пинцетом. Запрещается использовать шприцы со "стерильного стола" в перевязочной, проверять проходимость иглы, просасывая через нее воздух.

Кровь берут у постели больного или в перевязочной и тут же засевают на питательные среды. Рекомендуется осуществлять эти процедуры вдвоем. Один медицинский работник проводит обработку кожи больного, венопункцию и взятие крови, второй, в это время открывает над пламенем спиртовки пробки флаконов со средами, подставляет их под струю крови из шприца, обжигает горлышки флаконов и закрывает их.

Кожу над пунктируемой веной обрабатывают 70^о спиртом, затем 5% настойкой йода и опять спиртом, во избежание раздражения кожи. Венепункцию проводят после полного высыхания дезинфектанта.

Для бактериологического исследования необходимо 10-20 мл крови, которую тут же засевают на набор питательных сред. Соотношение крови и среды должно быть 1/10-1/60, для устранения бактерицидного действия крови путем ее разведения.

Следует отметить, что увеличение объема засеваемой крови в значительной мере увеличивает вероятность получения положительного результата. Показано, что увеличение объема засеваемой крови на 1 мл повышает вероятность обнаружения микроорганизмов на 3% [82]. Согласно отечественным нормативным документам кровь для бактериологического исследования у взрослых забирается в количестве не менее 10 мл, у детей - не менее 5 мл [43]. Эксперты ВОЗ рекомендуют брать у взрослых не менее 10 мл крови, у детей не менее 2-5, а у новорожденных - 1-2 мл.

Если предполагается проведение бактериоскопического исследования, дополнительно готовят препарат "толстая капля" и мазок. Для приготовления мазка каплю крови диаметром 2-3 мм наносят на обезжиренное предметное стекло вблизи от торца. Перед каплей крови ставят под углом 45^о стекло со шлифованным краем и плавным движением равномерно распределяют материал по поверхности.

Для приготовления препарата "толстая капля" на стекло наносят каплю крови диаметром около 5 мм и распределяют ее с помощью иглы или пипетки в диск диаметром 10-15 мм. Толщина капли должна позволять видеть через нее газетный шрифт. Иногда мазок и препарат "толстая" капля готовят на одном стекле. Для этого на поверхность приготовленного как описано выше мазка до его высыхания наносят еще одну каплю крови. Она, как правило, сама растекается в правильный диск необходимой толщины.

Препараты высушивают ("толстая капля" сохнет 2-3 часа) и доставляют в лабораторию с соблюдением необходимой осторожности. Мазки фиксируют смесью Никифорова и окрашивают.

Однократное исследование крови мало результативно, а в случае обнаружения условно патогенных микроорганизмов, обитающих на коже человека, без результатов повторных исследований трудно отдифференцировать истинную бактериемию от случайной контаминации. Поэтому всегда следует стремиться к проведению серии из 3 и более исследований за определенный промежуток времени.

Методы исследования. Минимальный набор питательных сред при исследовании крови согласно "Методическим указаниям по применению унифицированных микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях. " [43] включает две среды: “двойную среду “ и “среду для контроля стерильности”.

“Двойная среда”, состоит из скошенных во флаконе 150 мл 1,7-2% питательного агара и 150 мл полужидкой среды, приготовленной на питательном бульоне с добавлением 15 г глюкозы и 0,15 г агара. Кровь вносят в жидкую часть среды.

“Среда для контроля стерильности” готовится на основе стандартной тиогликолевой среды, к которой добавляют 15-20 г дрожжевого экстракта и 4,25-5,0 г агара на 1 литр. В качестве индикатора анаэробиоза добавляют 0,001 г резазурина, который краснеет в присутствии кислорода. В случае покраснения более 20% верхней части столбика среду регенерируют, прогреванием в течение 20 минут в кипящей водяной бане. Регенерацию можно провести лишь однократно.

В дополнение к двум указанным средам можно использовать: "среду со стаканчиком", полужидкую среду Тароцци, жидкую среду Сабуро.

“Среда со стаканчиком” позволяет лизировать форменные элементы крови. В ряде случаев исследование гемолизированной крови обеспечивает диагностику бактериемии в тех случаях, когда обычный посев оказывается отрицательным. Это обусловлено высвобождением микроорганизмов, адсорбированных на эритроцитах, либо расположенных внутри фагоцитов. Кроме этого, по данным некоторых авторов в этом случае ускоряется рост бактерий.

Для этого во флаконы с широким горлом емкостью 250 мл наливают 50 мл дистиллированной воды, содержащей 0,1% агара и с помощью пинцета погружают в неё стеклянный стаканчик (пробирку) диаметром 20-22 мм и высотой 70 мм. В нем содержится 12 мл специальной концентрированной питательной среды. Укомплектованный флакон стерилизуют 30 минут при 0,5 атм.

При посеве в агаризованную воду вносят 5-10 мл крови. Инкубируют 30-40 минут при комнатной температуре для лизиса форменных элементов. Затем флакон наклоняют и выливают содержимое стаканчика во флакон.

Полужидкая среда Тароцци используется для выделения анаэробов при отсутствии "среды для контроля стерильности". Жидкую среду Сабуро применяют для выделения грибов.

Посевы крови инкубируют при 37 ^оС с ежедневным просмотром в течение первых 8 дней. При отсутствии видимого роста на 3, 5 и 8 дни со всех сред, кроме “двойной среды” и “среды для контроля стерильности” делают высевы на кровяной агар и мазки по Граму. При отсутствии роста в течение 9-10 дней выдают отрицательный ответ, но инкубацию посевов продолжают до 6 недель с просмотром 2-3 раза в неделю, при этом ватно-марлевые пробки парафинируют смесью воск (1/3) - парафин (2/3).

При появлении признаков видимого роста делают мазки, окрашивают их по Граму и в зависимости от результата производят высевы на соответствующие питательные среды. При подозрении на анаэробную флору субкультуры инкубируют параллельно в аэробных и анаэробных условиях.

Ряд зарубежных фирм выпускают специальные питательные среды для исследования крови. В большинстве случаев они аналогичны “двухфазной среде” и “среде для контроля стерильности”. В качестве примера можно привести среды Haemoline Performance фирмы bioMеrieux. В набор для посева крови, выпускаемый указанной фирмой входят 2 среды. Среда Haemoline Performance diphasique - отличается от отечественной прописи двухфазной среды наличием в ее составе факторов роста: факторы X и V - необходимые для H.influenzae, Cardiobacterium, Actinobacillus и витамин В₆ - стимулирующий рост стрептококков. Кроме того пространство над поверхностью питательной среды во флаконе заполнено углекислым газом. Среда Haemoline Performance anaerobie предназначена для выделения анаэробов и содержит соответствующий набор факторов роста (аргинин, пируват, витамин К и др.), пространство над средой также заполнено углекислым газом.

Широкое распространение за рубежом получила система для обнаружения микроорганизмов в крови разработанная фирмой Oxoid – "Signal blood system". Система состоит из двух сосудов, соединенных между собой с помощью полой иглы. Нижний сосуд, заполнен специальной питательной средой и укупорен резиновой пробкой. После посева в пробку вставляют полую иглу, канюля которой вмонтирована в дно верхнего сосуда, исполняющего роль индикатора. При росте микроорганизмов образуются газообразные продукты метаболизма. В нижнем флаконе повышается давление, и часть питательной среды с кровью через иглу выдавливается в верхний индикаторный сосуд. Открыв крышку индикаторного сосуда можно взять материал для посева или приготовление мазка.

Такой подход позволяет регистрировать наличие бактериального роста на ранних этапах и резко упрощает процедуру ревизии посевов. При посевных дозах 1-13 клеток рост бактерий разных видов проявляется через 17-72 часа. Кроме того, состав используемой питательной среды обеспечивает рост не только аэробных, но и анаэробных бактерий, а также грибов.

Микроорганизмы в крови могут быть обнаружены и при бактериоскопическом исследовании, однако этот метод широко используется только при диагностике некоторых инфекционных заболеваний, например возвратных тифов. В.В. Федоровым, Н.М. Каргальцевой., В.И.Кочеровцом [64] показана высокая эффективность бактериоскопического исследования при бактериемиях различной этиологии. Кровь для бактериоскопического исследования при "правильном" типе лихорадки берут за 2 ч до ее возможного наступления, при "неправильном" - в вечернее время. Оставшуюся после посева кровь (4,5 мл) используют для приготовления лейкоконцентрата. Для этого ее смешивают с 0,5 мл 5% раствора цитрата натрия и центрифугируют при 1500 об./мин 10-20 мин. Плазму удаляют до "светлого слоя", лежащего поверх слоя эритроцитов. "Светлый слой" забирают капилляром Панченко, не касаясь эритроцитов, переносят в чистую пробирку и готовят мазки из 1 капли концентрата, используя технику "двух стекол" (шлифованное стекло). Фиксируют препараты метанолом в течение 2 минут, окрашивают по Граму и акридиновым оранжевым. Для микроскопии последних используют люминесцентный микроскоп со светофильтрами СЗС 24-4 и ФС1-2. Совпадение данных световой микроскопии и посева отмечено авторами у 1/3 больных, люминесцентной и посева - у 1/2.

Лягина И.А., Корнева Т.К. [34] предложили ускоренный метод исследования крови при бактериемии, включающий проведение как бактериоскопического, так и бактериологического исследования. Для этого 5 мл крови из локтевой вены вносят в центрифужную пробирку с 6% раствором цитрата натрия. Пробу центрифугируют при 1000 об./мин 20 мин. В боксе при строгом соблюдении правил асептики отбирают поверхностный слой клеточных элементов и готовят мазок по типу клинического мазка крови (размером с 10 копеечную монету). Окрашивают по Граму и просматривают до 100 полей зрения. Оставшийся материал используют для бактериологического исследования, при этом плазму и форменные элементы засевают отдельно на жидкие и плотные питательные среды. Такая методика посева обеспечивает ускорение анализа, так как образующийся при классическом методе сгусток фибрина препятствует развитию микроорганизмов, находящихся внутри него.

На наш взгляд, несмотря на наличие у методов, основанных на раздельном посеве крови серьезных достоинств, по крайней мере, два принципиальных недостатка будут всегда препятствовать их массовому применению. Это, во-первых, существенный риск случайной контаминации крови в процессе обработки, а во-вторых - высокая трудоемкость исследования.

В зарубежной практике исследование крови на гемокультуру является одним из наиболее массовых видов лабораторных исследований. В связи с этим там уделяется большое внимание созданию автоматизированных систем для индикации микробного роста в посевах крови. Их применение позволяет ускорить получение результата и, тем самым, способствует более раннему назначению адекватной терапии. Приборы для этой цели выпускаются многими фирмами. Они отличаются друг от друга производительностью, уровнем автоматизации, но главное - способами детекции микробного роста. Детекция микробного роста может осуществляться по продукции СО₂, изменению рН, электропроводности, окислительно-восстановительного потенциала или мутности питательной среды. В некоторых случаях одновременно учитывается несколько показателей. Одним из наиболее популярных в Европе автоматизированных бактериологических анализаторов для детекции культур крови является прибор VITAL, предлагаемый фирмой bioMerieux. Этот прибор позволяет одновременно исследовать до 1200 образцов. Проба крови, объемом 5-10 мл засевается во флакон со специальной питательной средой, обеспечивающий рост как аэробных, так и анаэробных микроорганизмов, включая медленно растущие виды со сложными пищевыми потребностями[2][1]. Флакон устанавливается в блок детекции прибора и инкубируется при осторожном встряхивании. Каждые 15 минут с помощью специальной флюоресцентной технологии прибор осуществляет детекцию микробного роста по продукции СО₂, изменению рН и модификации окислительно-восстановительного потенциала среды. Информация о получении положительного сигнала отражается звуковым сигналом, выводится на монитор компъютера и дублируется внутри модуля детекции, рядом с нужным флаконом. Время детекции от 9 до 120 часов (для медленно растущих видов).

Обнаружение в крови эндотоксина представляется в настоящее время не менее, а в отдельных случаях даже более ценным диагностическим пособием, чем классическое бактериологическое исследование. Для этой цели используют два основных методических подхода:

1. Люмулюс (ЛАЛ) тест. Тест основан на способности лизата амебоцитов краба Lumulus polyphemus образовывать гель в присутствии эндотоксина [80]. Чувствительность теста достигает 0,002 мг/л, что сопоставимо с чувствительностью физических методов анализа и достаточно для обнаружения эндотоксина в клинических образцах. К сожалению, люмулин, основной реагент для постановки теста, мало доступен в нашей стране.

2. РИФ. С помощью РИФ можно обнаружить эндотоксин, адсорбированный на поверхности микрофагов. Для этого используют сыворотки к общему антигену грамотрицательных бактерий (ядро липида А). Препараты для этих целей серийно не выпускаются.

Отсутствие возможности определения эндотоксина в условиях практических лабораторий вызывает сожаление, так как количество эндотоксина в плазме имеет важное прогностическое значение.

Таблица 3.

Микроорганизмы, обнаружение которых в крови требует применения специальных диагностических приемов

Микроорганизм	Специальные приемы выявления
Borrelia spp.	B.recurrentis, B.persica, B.latyschewwii и др. возбудители возвратных тифов - бактериоскопия мазков крови по Романовскому-Гимзе. B.burgdorferi - посев на специальные среды (на практике не применяется).
Brucella spp.	Использование специальных сред, инкубация в атмосфере содержащей 5-10% СО2.
Cardiobacterium hominis	Инкубация в атмосфере обогащенной СО2. Высев с жидких сред на плотные, содержащие в своем составе дрожжевой экстракт.
Legionella spp.	Высев с обычных аэробной и анаэробной сред для первичного посева крови на угольно-дрожжевой агар для легионелл.
Leptospira spp.	Микроскопия препаратов цитартной крови, посев крови по 5 капель в 3-5 пробирок с дистиллированной водой или специальной средой, биопроба.
Mycobacterium spp.[3][2]	Посев осадка после центрифугирования лизированной крови или использование автоматических бактериологических анализаторов.
Bartonella (Rochalimaea) spp.	Специальные методы предпосевной обработки крови, питательные среды и приемы инкубации.
Streptobacillus moniliformis	Микроскопия препаратов цитратной крови, специальные методы предпосевной обработки крови, инкубация в атмосфере СО2.

Дата добавления: 2015-09-06