Отделяемое из нижних отделов дыхательных путей

Показания к проведению исследования: воспалительные заболевания нижних отделов дыхательных путей. Диагностика инфекционных заболеваний: пневмококковой инфекции, сибирской язвы, чумы, туберкулеза.

Взятие исследуемого материала: перед сбором мокроты больному предлагают почистить зубы и прополоскать рот кипяченой водой. Предпочтительным является исследование утренней порции мокроты. Мокроту собирают в стерильную широкогорлую склянку. Удобно использовать для этих целей "карманные плевательницы". Так как маленькие дети не умеют отхаркивать мокроту и заглатывают её, для диагностики туберкулеза, у них исследуют промывные воды желудка.

Исследование промывных вод бронхов проводят при отсутствии или скудности мокроты. Это связано не только с технической сложностью взятия этого вида материала, но и с меньшей диагностической ценностью результата, из-за его значительного разбавления (концентрация микроорганизмов в промывных водах в 10-1000 раз меньше чем в мокроте). Простейший метод взятия трахеобронхиального смыва следующий: гортанным шприцем с помощью аппарата Боброва в трахею вводят около 10 мл стерильного физиологического раствора, и после возникновения кашля собирают откашлянный трахеобронхиальный смыв. У маленьких детей через катетер вводят в трахею 5-10 мл физиологического раствора и затем отсасывают трахеобронхиальный смыв [9].

Бронхиальные смывы могут быть получены при бронхоскопии. В этом случае не рекомендуется вводить в бронх более 5 мл физиологического раствора.

Наиболее достоверные результаты достигаются при взятии материала непосредственно из очага инфильтрации или абсцесса с помощью проводимой под рентгенологическим контролем трансторокальной пункции. По мнению Л.А.Вишняковой и соавт. [9], "тяжесть данной манипуляции компенсируется значительно более точным определением этиологии и этиотропной терапии заболевания".

Методы исследования. Для приготовления мазка из мокроты, распределенной тонким слоем по дну чашки Петри, с помощью двух игл или пинцета выбирают слизистые либо гнойные комочки и переносят их на середину предметного стекла. Затем берут второе стекло и накладывают поверх первого. Комочки мокроты растирают между двумя стеклами до тех пор, пока не получится достаточно тонкий мазок. При этом, во избежание инфицирования рук работающего, и на первом и на втором стеклах мазки не должны занимать более 1/2-2/3 поверхности. Препараты высушивают и фиксируют над пламенем. Один из мазков окрашивают по Граму, второй микроскопируют неокрашенным, для выявления друз актиномицетов или мицелия грибов.

При микроскопии мазка необходимо обратить внимание на наличие и характер клеточных элементов. Хотя их оценка - задача, решаемая при клиническом анализе мокроты, но их выявление позволяет бактериологу проверить правильность взятия материала и составить представление о характере патологических изменений. Для воспалительных процессов в нижних отделах дыхательного тракта характерно наличие гранулоцитов. Присутствие в материале большого количества эпителиальных клеток, особенно в сочетании с отсутствием гранулоцитов, свидетельствует о том, что материал был взят неправильно (с примесью слюны). В этом случае исследование следует повторить. Для острой инфекции характерно наличие в мокроте 1-2 видов бактерий, расположенных вблизи гранулоцитов. Микроорганизмы - контаминанты мокроты, попавшие в нее из ротовой полости, напротив, чаще расположены вблизи эпителиальных клеток.

Микроскопической оценке правильности взятия материала многие микробиологи придают чрезвычайно большое значение. Американским руководством по клинической микробиологии [81] рекомендовано применение для этих целей одной из специально разработанных количественных шкал оценки. Использование каждой из них предполагает микроскопию окрашенного по Граму мазка из гнойной части мокроты под малым увеличением (объектив х10). При использовании шкалы Barlett просматривают 20-30 полей зрения, давая каждому оценку путем суммирования баллов из таблицы 7. Затем рассчитывают средний балл: складывают все начисленные баллы и делят сумму на количество просмотренных полей. Если полученный результат равен 0 или менее вероятность воспаления мала или мокрота вероятно контаминирована в ротовой полости. Такие образцы не подлежат бактериологическому исследованию, и взятие мокроты должно быть повторено.

При оценке мокроты по Murray Washington принадлежность образца к определенной группе устанавливается по таблице 8. При этом бактериологическому исследованию подлежат только образцы принадлежащие к 4-5 группе.

Таблица 8

Схема Barlett оценки правильности взятия мокроты
(цитируется по [81])

Тип клеток и их количество в поле зрения при микроскопии с объективом х10	Балл
Нейтрофилы	<10
10-25	+1
>25	+2
Присутствие слизи	+1
Эпителиальные клетки	10-25	-1
>25	-2

Таблица 8

Схема Murray Washington оценки правильности взятия мокроты
(цитируется по [81])

Группа	Количество в поле зрения при микроскопии с объективом х10
Эпителиальных клеток	Лейкоцитов
		10-25
	10-25
	<10

По морфологическим и тинкториальным признакам при микроскопии мазка, окрашенного по Граму, можно ориентировочно идентифицировать следующие микроорганизмы, часто присутствующие в мокроте:

· скопления грамположительных кокков - Staphylococcus spp.; Micrococcus spp.;

· цепочки грамположительных кокков - Streptococcus spp.;

· ланцетовидные грамположительные диплококки, окруженные капсулой - S.pneumoniae;

· грамотрицательные диплококки - Neisseria spp.;

· грамотрицательные палочки - Enterobacteriaceae; Pseudomonas spp., Haemophilus spp.; неспорообразующие анаэробы и др.;

· грамотрицательные палочки с закругленными концами, окруженные капсулой - Klebsiella spp.;

· мелкие полиморфные грамотрицательные палочки в виде скоплений - Haemophylus spp.;

· обрывки тонкого несептированного ветвящегося мицелия фиолетового цвета, споры темно-фиолетового цвета и друзы розового цвета - Actinomyces spp.

При бактериоскопическом исследовании диагностически значимым является обнаружение 3 и более пневмотропных микроорганизмов в большинстве полей зрения. Анализ результатов микроскопии мазка мокроты в сочетании с клинико-рентгенологическими особенностями течения заболевания, позволяет поставить ранний клинико-бактериологический диагноз у 86% больных острой пневмонией и у 90% больных пневмококковой пневмонией [68], или, по крайней мере, облегчает выбор антибиотика на основании преобладания грамположительной или грамотрицательной флоры [45]. П.О. Вязицкий и соавт. [11] рекомендуют следующую схему для выбора антибактериальных препаратов в зависимости от результатов микроскопического исследования мокроты:

1) грамположительные диплококки с капсулой или кокки, расположенные в виде цепочек - пенициллин или эритромицин;

2) грамположительные стафилококки - оксациллин + гентамицин или цепорин + гентамицин;

3) грамотрицательные палочки - гентамицин.

По мнению упомянутых авторов, "при обнаружении грамположительных кокков, отнесенных по своим свойствам к пневмококкам или стрептококкам, больному назначается пенициллин (при аллергии к препаратам группы пенициллина - эритромицин), и дальнейшее бактериологическое исследование не проводится". Такой подход позволяет повысить эффективность лечения, за счет выбора адекватной терапии уже в первые часы после поступления больного и разгрузить лаборатории, освободив их от ненужных и трудоемких исследований, т.к. в 50-80% случаев исследование мокроты можно будет закончить микроскопией мазка по Граму. По нашему мнению вышеизложенная точка зрения в настоящее время должна быть пересмотрена с учетом все более широкого распространения пенициллинрезистентных пневмококков, что не всегда позволяет выбрать адекватную схему лечения без бактериологического исследования. Так, исследование, проведенное в США, показало, что в 1993-94 гг. распространенность пенициллинрезистентных штаммов Streptococcus pneumoniae составила 3,2%, тогда как в 1979-87 гг. резистентные штаммы не выявлялись вовсе. Неуклонно нарастает число таких штаммов и в Европе [46].

Особо необходимо подчеркнуть важность бактериоскопического исследования мокроты при деструктивных пневмонитах (абсцесс легкого, гангрена легкого). По мнению Н.В.Путова и Ю.Н.Левашова [54] опытный микробиолог на основании морфологии микроорганизмов, выявляемых при бактериоскопии, может высказать более точное суждение об этиологии процесса, чем это удается сделать при анализе результатов рутинного бактериологического метода. Это связано с тем, что посев на обычно применяемые на сегодняшний день в практических лабораториях среды, не всегда позволяет обнаружить облигатных анаэробов, имеющих исключительно большое значение при данной патологии. Кроме того результаты целенаправленного исследования на неспорообразующие облигатно анаэробные микроорганизмы можно получить лишь на 7-8 дни.

В качестве основного приема культурального исследования мокроты “Методическими указаниями по применению унифицированных микробиологических методов...” [43] предусмотрен посев мокроты на 5% кровяной агар. При необходимости для первичного посева дополнительно могут быть использованы: среда ВНИИП, ЖСА, шоколадный агар, среды Эндо и Сабуро.

Существуют два принципиальных подхода к культуральному исследованию мокроты: качественный и количественный. При использовании качественного метода исследования мокроту выливают в чашку Петри и с помошью игл, пинцета и т.п. выбирают 2-3 гнойных комочка. Комочки мокроты трехкратно отмывают стерильным физиологическим раствором для удаления наслоившейся в верхних дыхательных путях и в полости рта микрофлоры. Затем их переносят на питательную среду и тщательно равномерно растирают шпателем по ее поверхности. Посевы инкубируют при 37 ^оС.

Промывные воды бронхов засевают аналогичным образом, но без предварительной отмывки гнойных комочков.

В основе количественного метода лежит высев на плотные питательные среды разведений, приготовленных из гомогенизата мокроты. Для этого к 1 мл мокроты добавляют 9 мл питательного бульона или 2% пептонной воды и гомогенизируют в банке со стеклянными бусами 20 минут[6][5] или путем растирания в ступке с кварцевым песком (в этом случае бульон добавляют небольшими порциями в процессе обработки).

Приготовленный гомогенат мокроты принимается за разведение материала 10^-1. Из него готовят ряд серийных десятикратных разведений до 10 ^-7 в бульоне или в пептонной воде. Каждое последовательное разведение готовят новой пипеткой!

Из “нечетных” разведений (10 ^-1;10 ^-3; 10^-5; 10^-7 ) засевают по 0,1 мл на чашки с 5% кровяным агаром и шоколадным агаром. Посевы рекомендуется инкубировать в эксикаторе “со свечой” при 37 ^оС в течение суток. Дополнительно можно провести посев на среды Эндо, Сабуро, ЖСА из исходного разведения 10^-1 . Количество микроорганизмов определяют в максимальном разведении, в котором еще удалось обнаружить рост микроорганизмов.

Сопоставление эффективности количественного и качественного методов исследования мокроты было проведено А.Н.Калюк и К.Н.Полянской [23]. По их мнению, оба метода достаточно информативны, а полученные с их помощью результаты тесно коррелируют друг с другом. В то же время исследование мокроты количественным методом без предварительной отмывки гнойных комочков снижает информативность исследования и может способствовать увеличению выделения пневмококков, вегетирующих на слизистых оболочках носоглотки. На необходимость отмывки мокроты указывают и Т.С.Агеева и соавт. [1], однако по их данным, напротив, рост пневмококков и гемофильных палочек, при посеве не отмытой мокроты ингибируется сопутствующей микрофлорой.

Для гомогенизации мокроты могут быть использованы химические методы. К ним относятся обработка мокроты муколитиками (ацетилцистеин, мукосальвин и др.) или ферментами (трипсин, хемотрипсин, панкреатин). По мнению Л.А.Вишняковой и соавт. [9], наиболее эффективным является применение ацетилцистеина. При этом в неметаллическом сосуде с помощью пипетки с грушей в течение 1-2 минут тщательно перемешивают равные объемы мокроты и 0,5% раствора ацетилцистеина. Применение ацетилцистеина особенно целесообразно для выделения Haemophilus influenzae, так как позволяет снизить ингибирующее действие муцина на гемофильные палочки.

Ферменты могут оказывать повреждающее действие на микроорганизмы, кроме того процесс гомогенизации мокроты с их помощью наиболее продолжителен по сравнению с другими химическими и механическими методами.

Описаны многочисленные модификации количественных методов посева мокроты. Ряд авторов использовал для этой цели различные модификации посева петлей на сектора с использованием калиброванной петли на 0,01 мл по аналогии с методом Gould, широко используемым при исследовании мочи [1, 58]. В.В.Акользин [2] предложил использовать калиброванные петли не только для посева, но и для приготовления разведений. Однако все эти методы не получили широкого распространения.

Оценка диагностической значимости полученных результатов.

Оценка результатов бактериологического исследования проводится на основании сочетанного анализа информации о видовом составе микрофлоры (по данным бактериоскопического и бактериологического исследований), численности отдельных видов микроорганизмов, стабильности их выделения во времени, клинических данных и результатов терапии.

В целом лидирующее положение в этиологии внебольничных пневмоний занимают пневмококки. Например, по данным, Л.А.Вишняковой и соавт. [10] 97,1% пневмоний у детей в возрасте от 1 месяца до 14 лет имели пневмококковую этиологию. При оценке результатов бактериологического исследования необходимо принимать во внимание господствующее значение определенных видов микроорганизмов в типичных клинических ситуациях. Так, крупозная пневмония вызывается пневмококками; лобарная пневмония чаще всего пневмококками, клебсиеллами, стафилококками; очаговые пневмонии - пневмококками, гемофильными палочками, энтеробактериями, синегнойными палочками [18]. Первичная атипичная пневмония чаще всего обусловлена микоплазмами, легионеллами или хламидиями; пневмония на фоне хронического бронхита - гемофильной палочкой, стрептококками; пневмония на фоне гриппа - стафилококками, пневмококками, гемофильными палочками; аспирационная пневмония - энтеробактериями, синегнойной палочкой, анаэробами; пневмония на фоне иммунодефицита - энтеробактериями, стафилококками [45]. Госпитальная пневмония у новорожденных (0-7 дней) чаще всего связана со Streptococcus spp., Escherichia coli, реже: Staphylococcus aureus, Chlamydia trachomatis, Pseudomonas spp. [70]. Острые бронхиты и бронхиолиты, вызываются, как правило, вирусами или микоплазмами, но со 2-3 дня заболевания осложнятся наслоением бактериальной инфекции (чаще всего обусловленной пневмококками или гемофильной палочкой) [5]. Бронхолегочная инфекция у больных муковисцидозом наиболее часто вызывается синегнойной палочкой [24]. Господствующая роль в этиологии острых инфекционных деструкций легких принадлежит несорообразующим анаэробам, стафилококкам [54].

Для ориентировочной оценки численности микроорганизмов в мокроте и их этиологической роли используется следующая схема:

I - очень скудный рост - рост единичных колоний (до 10);

II - скудный рост - рост 10 - 25 колоний;

III - умеренный рост - рост множества сосчитываемых колоний (не менее 50);

IV - обильный рост - сплошной рост не сосчитываемых колоний.

I и II степени роста свидетельствуют в пользу загрязнения или носительства, а III и IV - в пользу этиологической значимости данного микроорганизма [43].

Более сложную схему оценки этиологии инфекционного процесса предлагают Л.А.Вишнякова и соавт. [9]. Её применение подразумевает выполнение лабораторией количественного посева мокроты. Согласно данной схемы этиология острой пневмонии может быть определена на основании одного из следующих критериев:

Обнаружение монокультуры S.pneumoniae в крови или в плевральном эксудате.

Выделение пневмококка или гемофильной палочки в количестве 10⁶ кл./мл в мокроте или 10⁴ - в трахеобронхиальном смыве.

Выявление в течение заболевания при помощи реакции непрямой иммунофлуоресценции 4-кратного или более значительного изменения первоначального титра антипневмококковых антител или титра 1:320 для детей 0-3 лет или 1:640-1:1280 для взрослых больных.

При обследовании больных острой пневмонией на поздних сроках болезни и на фоне этиотропной антибактериальной терапии обнаружение в мокроте или трахеобронхиальных смывах низких концентраций (менее 10⁶ или 10⁴ кл./мл) пневмококка с последующим снижением их не менее чем в 100 раз или при одновременном выявлении антипневмококковых антител в титре 1:640.

При возникновении вторичного инфекционного процесса выделение в 2-3 последующих исследованиях с интервалом 2-5 дней одного и того же вида условно-патогенных бактерий в концентрации 10⁶ кл./мл в мокроте или 10⁴ кл/мл в трахеобронхиальном смыве в сочетании с выявлением местной или системно-иммунологической реакции организма на этот возбудитель.

Обнаружение пневмококкового антигена в крови, плевральном эксудате или моче.

Этиологию внебольничных пневмоний с помощью стандартных методов лабораторного исследования не удается установить в 30-50% случаев. По мнению А.И.Синопальникова и соавт. [59], это обусловлено рядом обстоятельств:

1. примерно у 30% больных пневмонический кашель имеет не продуктивный характер;

2. часть возбудителей (Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumoniae и др.) не могут быть обнаружены с помощью рутинных методов (табл. 9);

3. в ряде случаев трудно правильно отдифференцировать "резидентную" флору и возбудитель;

4. не всегда удается получить мокроту, пригодную для бактериологического исследования (см. выше);

5. часть больных получает антибиотики до начала бактериологического обследования.

Таблица 9

Некоторые специальные методы диагностики заболеваний, обусловленных отдельными пневмотропными микроорганизмами.

Микроорганизм	Специальные приемы выделения возбудителя или диагностики заболевания.
Mycobacterium spp.	Бактериоскопия мазков из обогащенной флотацией мокроты, окрашенных флюорохромом в люминесцентном микроскопе. Посев специальным образом обработанной мокроты на среду Левенштейна-Иенсена. Биопроба.
Chlamydia pneumoniae	Заражение культур клеток (редко). Серодиагностика
Mycoplasma pneumoniae,	Индикация АГ в ИФА, выделение на элективных средах, серодиагностика.
Legionella pneumoniae	Посев на специальные питательные среды и биопроба (редко). Серодиагностика.

В зарубежной практике при диагностике пневмоний часто используется исследование крови. Безусловно, обнаружение возбудителя в крови позволяет наиболее точно судить об этиологии процесса, однако, по данным Л.А.Вишняковой и соавт.[10], исследования крови эффективны лишь в первые 2-3 дня болезни и бывают положительными только у 10-25% больных.

Желчь

Показания к проведению исследования: воспалительные заболевания желчного пузыря и желчных протоков (холециститы, холангиты, желчнокаменная болезнь).

Диагностика брюшного тифа и брюшнотифозного бактерионосительства.

Взятие исследуемого материала: желчь получают путем зондирования, реже, во время операции при пункции желчного пузыря. При зондировании желчь собирают в 3 стерильные пробирки раздельно по порциям А, В, С. Пробы должны быть доставлены в лабораторию в течение 1-2 часов.

Методы исследования. При бактериологическом исследовании по 0,1 мл каждой порции желчи засевают на кровяной агар, по 0,5 мл - на среду Эндо. Для выделения сальмонелл желчь засевают в соотношении 1:9 в селенитовый бульон, а также помещают в термостат нативную желчь. В последующем на протяжении 3 дней ежедневно производят высев, как с селенитового бульона, так и с нативной желчи на висмут-сульфит агар. Для выделения анаэробов посевы проводят в одну пробирку со "средой для контроля стерильности" или в 2 пробирки со средой Тароцци. В последнем случае одну из засеянных пробирок со средой Тароцци прогревают на водяной бане для уничтожения неспрообразующих микроорганизмов. Наблюдение за посевами ведут в течение 5 дней.

Оценка диагностической значимости полученных результатов.

Желчь, полученная в результате дуоденального зондирования, практически неизбежно содержит микроорганизмы, попавшие в неё из ротовой полости и верхних отделов пищеварительного тракта. На контаминацию желчи микрофлорой полости рта указывают находки в ней нейссерий и дрожжеподобных грибов. Стафилококки и стрептококки значительно чаще обнаруживаются в желчи, полученной при зондировании, чем в образцах взятых при пункции пузыря. Поэтому наиболее достоверными являются результаты исследования проб, полученных во время операции.

При оценке результатов необходимо учитывать количество микроорганизмов в материале. Прогностически неблагоприятным, в случае планируемого оперативного вмешательства, считается обнаружение в желчи бактерий (энтеробактерий - Escherichia coli и др., псевдомонад, бактероидов) в количестве более 10³ кл. в 1 мл. Находка значительных количеств Staphylococcus aureus может свидетельствовать о печеночном или поддиафрагмальном абсцессе [43].

Моча

Показания к проведению исследования: подозрение на воспалительные заболевания почек и мочевого пузыря. Диагностика инфекционных заболеваний: брюшного тифа (с конца 2 недели заболевания), лептоспироза.

Взятие исследуемого материала: в стерильную посуду собирают среднюю порцию свободно выпущенной мочи в количестве 3-5 мл. Перед взятием материала больной должен совершить тщательный туалет наружных половых органов. Экспертами ВОЗ [74] предложены следующие инструкции по сбору мочи для мужчин и женщин:

Для мужчин:

Тщательно вымыть руки;

Обнажить головку полового члена (если не было обрезания) и выпустить небольшую порцию мочи;

Прервать мочеиспускание и выпустить порцию мочи в контейнер;

Закрыть контейнер и передать в лабораторию.

Для женщин:

Тщательно вымыть руки;

Вымыть половые органы, используя стерильные марлевые салфетки и теплую мыльную воду, в направлении спереди назад;

Промыть половые органы еще раз теплой водой и вытереть стерильной салфеткой. На протяжении всей процедуры держать половые губы раздвинутыми и не касаться их пальцами;

Помочиться, отбросив первую порцию мочи. Собрать порцию мочи в стерильный контейнер.

Закрыть контейнер и передать в лабораторию.

Катетеризацию целесообразно использовать для сбора мочи только для уточнения локализации инфекции: в почках или в мочевом пузыре. Для этого мочевой пузырь опорожняют катетером, промывают раствором антисептика (50 мл раствора, содержащего 40 мг неомицина и 20 мг полимиксина) и через 10 минут забирают пробы мочи. При инфекциях мочевого пузыря моча остается стерильной.

Наиболее достоверные результаты могут быть получены при надлобковой пункции мочевого пузыря, но эта процедура сопряжена с опасностью для больного.

Пробы мочи могут храниться до начала исследования не более 1-2 часов при комнатной температуре и не более суток в холодильнике, так как имеется риск размножения бактерий и искажения результатов исследования.

Методы исследования. Исследования мочи относятся к числу наиболее массовых в практике лабораторий клинической микробиологии. На них приходится от 40 до 70% от общего числа анализов, при этом до 80% анализов негативны. [76]. Это заставило искать новые подходы к исследованию мочи, позволяющие снизить нагрузку на лаборатории и стоимость исследования. Достигнуть этого можно либо путем использования не бактериологических методов исследования (химические пробы, бактериоскопия), либо путем разработки упрощенных методов посева, выполнимых в условиях кабинета врача общей практики.

Согласно рекомендациям экспертов ВОЗ [74] предусматриваются следующие этапы лабораторного исследования мочи:

Приготовление и окраска мазков по Граму.

Скрининг проб при выраженной бактериурии с помощью химических тестов.

Окончательное культивирование проб мочи, результаты скрининга которых оказались положительными, а также культивирование всех проб мочи, полученных с помощью цистоскопии, пункции мочевого пузыря и катетеризации.

Определение чувствительности к антибиотикам для клинически значимых культур.

Микроскопическое исследование мазков мочи, окрашенных по Граму, позволяет выявить бактериурию при концентрациях микроорганизмов от 10⁵ кл./мл и выше. При этом данные иммерсионной микроскопии совпадают с результатами бактериологического исследования в 90% случаев [76]. Наличие одного или более лейкоцитов в поле зрения является характерным индикатором инфекции мочевыводящих путей. Присутствие в мазках мочи, взятых у женщин, большого количества слущенного эпителия может быть признаком контаминации мочи влагалищной микрофлорой и указывает на целесообразность повторения исследований [74].

Препарат для микроскопии готовится из нативной мочи. На предметное стекло наносится с помощью пипетки капля мочи в 50 ml. Для ускорения высыхания препарата, без существенной потери в чувствительности, объем капли можно уменьшить до 10 ml и использовать для ее нанесения калиброванную петлю. Высушенные препараты фиксируют в пламени спиртовки и микроскопируют с масляной иммерсией, просматривая не менее 50 полей зрения по диаметру капли. Положительным считается результат, при котором в среднем в одном поле зрения присутствуют 2 и более микробные клетки [76].

Некоторые авторы предлагают исследовать осадок мочи после центрифугирования. Например, Рябинский В.С., Родомана В.Е., [56] рекомендуют следующий подход: 10 мл мочи в градуированной конической пробирке центрифугируют 5 минут при 3500 об./мин, затем удаляют верхние 9,5 мл, а из остатка 0,01 мл переносят на предметное стекло и микроскопируют. Диагностически значимым считается обнаружение 9-16 бактерий в 10 полях зрения (в среднем 2 в одном поле).

Скрининговые методы исследования мочи могут рассматриваться как альтернатива микроскопическому исследованию. Они основаны на выявлении ферментов микроорганизмов или лейкоцитов в моче.

В нашей стране рекомендованы к применению два ускоренных метода исследования мочи, основанных на регистрации активности микробных ферментов: нитритный тест и ТТХ тест.

Нитритный тест основан на выявлении c помощью реактива Грисса нитритов, которые восстанавливают из нитратов микроорганизмы из семейства Enterobacteriacea. Появление красного окрашивания при добавлении к 1 мл мочи 1 мл реактива свидетельствует о присутствии бактерий в количестве не менее 10⁵ клеток в 1 мл.

Для повышения эффективности теста можно за 2-4 часа до постановки теста добавить в мочу нитраты и проинкубировать при 37 ^оС.

ТТХ-тест основан на преобразовании тринитрозолия хлористого под действием микробных ферментов в красный нерастворимый в воде трифенилформазан. При постановке теста к 2 мл мочи добавляют 0,5 мл рабочего раствора ТТХ. Смесь инкубируют 4 часа в термостате при 37 ^оС. Появление красного осадка на дне пробирки свидетельствует о присутствии бактерий в количестве более 10⁵ клеток в 1 мл [43].

Несмотря на все достоинства скрининговых методов исследования, все они по своей информативности не могут заменить культуральный метод. Поэтому, выявленные с их помощью положительные пробы в дальнейшем должны исследоваться бактериологическим методом.

Согласно используемых в нашей стране унифицированных методов микробиологических исследований при исследовании мочи используют метод секторных посевов (метод Gould) [43]. Платиновой петлей диаметром 2 мм, емкостью 0,005 мл берут каплю мочи и делают 30-40 штрихов на сектор А чашки Петри. Прожигают петлю и производят 4 штриха через сектор А в сектор I. Аналогичным образом из сектора I засевают сектор II, а из сектора II - сектор III (рис. 1). Чашки инкубируют при 37 ^оС 24 часа. При отсутствии роста на кровяном агаре инкубацию пролонгируют до 3 суток. Учет результатов проводят по специальной таблице (табл.10).

Рисунок 1 Секторный посев мочи

Таблица 10

Учет результатов посева мочи секторным методом

A	I	II	III	К-во в 1 мл
1-6	-	-	-	<1000
8-20	-	-	-
20-30	-	-	-
30-60	-	-	-
70-80	-	-	-
100-150	5-10	-	-
не сосч.	20-30	-	-
-"-	40-60	-	-	1 млн.
-"-	100-150	10-20	-	5 млн.
-"-	не сосч.	30-40	-	10 млн.
-"-	-"-	60-80	ед.кол.	100 млн.

Посев проводят на питательный агар, 5% кровяной агар и 0,25% сахарный бульон. При латентном течении уроинфекции или в случае антибиотикотерапии рекомендуется дополнительно производить посев 0,1 мл мочи на плотные питательные среды и в пробирку с 0,25% бульоном.

На сегодняшний день широкое распространение за рубежом получили системы, в которых посев осуществляется путем погружения пластинки со средой в сосуд с мочой. На две стороны пластины могут наноситься разные среды. Результат оценивается путем визуального сравнения густоты роста со специальной шкалой. Примером подобной системы является набор " Uricult" Orion Diagnostica, Finland.

Некоторые фирмы выпускают более сложные системы, основанные на этом же принципе посева. Их состав предусматривает быструю ориентировочную идентификацию выросших микроорганизмов по некоторым ключевым биохимическим тестам. Так, система Uriline ID, bioMerieux позволяет дифференцировать кишечные палочки и протеи по ферментации b-глюкоронидазы и триптофандезаминазы, продукции индола. Система Uriselect, Diagnostics Pasteur, с помощью двух основных сред и дополнительных реактивов позволяет оценить ферментацию лактозы, продукцию индола, b-глюкоронидазы и триптофан дезаминазы. Это, в сочетании с оксидазным, каталазным тестами и окраской по Граму позволяет дифференцировать около 10 видов микроорганизмов.

Внедрение подобных систем позволяет перенести значительную часть работы из лаборатории в "кабинет врача", где собственно проводится посев, инкубация и первичная оценка результатов. Посевы, в которых количество бактерий менее диагностически значимого, тут же уничтожают, а оставшиеся направляют в лабораторию для точной идентификации микроорганизмов и определения антибиотикограммы.

Оценка диагностической значимости полученных результатов.

В мочевом пузыре в норме моча стерильна, но во время прохождения через нижнюю треть уретры происходит ее контаминация нормальной микрофлорой. В связи с этим при оценке результатов исследования на первый план выходят количественные критерии, позволяющие дифференцировать бактериурию, связанную с патологическим процессом и естественное загрязнение. При этом используются следующие критерии:

1. Количество микроорганизмов, не превышающее 10³ клеток в 1 мл, свидетельствует о естественной контаминации мочи;

2. Обнаружение микроорганизмов в количестве от 10³ до 10⁵ клеток в 1 мл рассматривается как сомнительный результат и требует повторения исследования.

3. Обнаружение бактерий в количестве, превышающем 10⁵ клеток в 1 мл, свидетельствует о наличии воспалительного процесса [43].

Следует отметить, что указанные численные границы в достаточной мере условны. Так, в зарубежной практике, как правило, за границу «случайная контаминация - сомнительный результат» принимается концентрация бактерий 10⁴ кл./мл.

В отдельных случаях воспалительные процессы в мочевыводящей системе могут протекать и при низких уровнях бактериурии. Это бывает на фоне форсированного диуреза (низкий удельный вес мочи), на фоне антибиотикотерапии, в сочетании с низкими (менее 5) значениями рН мочи. В этом случае постановке диагноза помогает анализ видового состава микрофлоры. Обнаружение эшерихий, протеев, синегнойной палочки, клебсиелл - должно расцениваться как неблагоприятный признак. Находки дифтероидов, лактобацилл, грамположительных палочек свидетельствуют о загрязнении нормальной микрофлорой. Обнаружение монокультуры в сочетании с высокой степенью бактериурии характерны для острого воспалительного процесса, ассоциации микроорганизмов более характерны для хронических процессов.

Дата добавления: 2015-09-06