Виды хемилюминесценции биологических систем.

Биолюминесценция представляет собой довольно интенсивное свечение, наблюдаемое у ряда биологических объектов и связанное с наличием специализированных ферментных систем, специально предназначенных для генерации квантов света. Классическим примером такой ферментной системы является люциферин-люциферазная светляков. Излучение квантов хемилюминесценции в ходе работы этой системы происходит вследствие окисления специального вещества – люциферина (D-2-(6’-окси-2-бензотиазолил)-D₂-тиазолин-4-карбоновая кислота) который затем восстанавливается под действием фермента люциферазы. Схема процессов, протекающих в ходе функционирования люциферин-люциферазной системы светляков, представлена на рис. 26.

Рисунок 26. Схема процессов, определяющих генерацию биолюминесценции у светляков. R₁ – оксибензотиазиновая группа люциферина; ЛФ – люцифераза; АД – аденозин. В целях упрощения некоторые атомы водорода не указаны.

Публикуется с модификациями по: Рощупкин Д.И., Артюхов В.Г. Основы фотобиофизики: Учебное пособие. Воронеж: ВГУ, 1997, с. 30.

Поскольку излучение квантов означает, что испускающая их система теряет энергию, длительное свечение возможно при условии восполнения тем или иным образом теряемой энергии. В случае биолюминесценции восполнение энергии, теряемой с квантами свечения, происходит с помощью аденозинтрифосфата (АТФ). В отсутствие этого макроэргического соединения свечение люциферин-люциферазной системы быстро затухает. Если же окисление люциферина протекает с достаточной скоростью, квантовый выход свечения оказывается очень высок – квант хемилюминесценции испускается 4 окисленными молекулами люциферина из каждых 5 образовавшихся. Генерируемая при функционировании люциферин-люциферазной системы хемилюминесценция располагается в видимой области спектра (500-650 нм), а максимум излучения приходится на 550-575 нм (в зависимости от вида светляка). Интересно, что положение максимума в спектре люциферин-люциферазной системы определяется видом светляка, люцифераза которого используется. Это дает основания полагать, что спектр излучения меняется вследствие различий в свойствах комплекса возбужденного продукта окисления люциферина с конкретной люциферазой.

Выраженная зависимость люциферин-люциферазной биолюминесценции от количества доступных макроэргических соединений (АТФ, ГТФ и т.д.) в образце позволяет применять анализ этого вида свечения для точного определения содержания таких соединений в исследуемом образце. В настоящее время доступны различные синтетические субстраты с ковалентно присоединёнными к ним молекулами АТФ. Распад этих субстратов при тех или иных условиях сопровождается высвобождением этого макроэргического вещества в среду в свободном виде. В присутствии люциферина и люциферазы при таком распаде будет выявляться весьма яркое свечение объекта, по кинетике которого можно оценить, например, эффективность функции разрушающего синтетический субстрат фермента. Возможны и иные варианты использования подобных субстратов.

Другой пример биолюминесценции – свечение некоторых видов бактерий. Биолюминесценция бактерий связана с окислением 2 основных субстратов: восстановленного флавинмононуклеотида (ФМН*Н₂) и длинноцепочечного алифатического альдегида (например, миристинового С₁₂Н₁₂СНО). Схема процессов, приводящих к генерации квантов биолюминесценции у бактерий, приведена на рис. 27.

Квантовые выходы генерации квантов биолюминесценции у бактерий гораздо ниже, чем у люциферин-люциферазной системы светляков и лежат в интервале от 0,04 до 0,17. Спектр излучения расположен в спектральной области 430-600 нм, а спектральное положение максимума испускания зависит от вида бактерии. Обычно этот максимум находится в интервале от 472 до 545 нм.

Биохемилюминесценция (сверхслабое свечение) – низкоинтенсивное (с интенсивностью порядка 10³ квант/см²/с) свечение тканей и клеток, не связанное с наличием специализированных ферментных систем. Причиной этой хемилюминесценции является генерация в биологических образцах свободных радикалов (супероксидного радикала, кислорода в синглетном состоянии, гидроксильного радикала, перекисных радикалов и т.д.). Часть продуцируемых радикалов затем рекомбинирует, обуславливая формирование продуктов в электронно-возбужденном состоянии. В качестве примеров свечения данного типа можно привести хемилюминесценцию при перекисном окислении липидов и при активации фагоцитирующих клеток.

Рисунок 26. Схема процессов, определяющих генерацию биолюминесценции у бактерий. R₂ и R₃ – соответственно, остаток рибитолфосфата и углеводородная часть альдегида; ЛФ – люцифераза. В целях упрощения некоторые атомы водорода не указаны.

Публикуется с модификациями по: Рощупкин Д.И., Артюхов В.Г. Основы фотобиофизики: Учебное пособие. Воронеж: ВГУ, 1997, с. 33.

При перекисном окислении липидов (или, как сейчас часто обозначают этот процесс, липидной пероксидации, от английского «lipid peroxidation») субстратом окисления служат свободные ненасыщенные жирные кислоты или остатки этих кислот в составе липидов (например, фосфолипидов клеточных мембран). Обозначим такой жирнокислотный остаток RH. При отрыве атома водорода в a-положении по отношению к двойной связи с образованием алкильного радикала и последующем присоединении к этому радикалу кислорода происходит перегруппировка алкильной цепи жирной кислоты с формированием диеновой структуры и перекисного радикала этой кислоты ROO^·. Кванты биохемилюминесценции генерируются затем вследствие рекомбинации части образовавшихся радикалов ROO^·:

ROO^· + ROO^· ® Р^*₁ +Р₂

Константу скорости этой реакции (реакции квадратичного обрыва цепей окисления) принято обозначать k₆. Если квантовый выход излучения квантов хемилюминесценции возбужденным продуктом рекомбинации радикалов ROO^· принять равным q_хл, то общая интенсивность свечения может быть описана выражением:

(104)

В этом выражении V – объем образца, - скорость генерации Р^*₁ в единице объема.

Поскольку интенсивность данного типа свечения невысока, при ее регистрации достаточно часто применяют различные активаторы свечения. Наиболее распространенный из них – люминол, механизм действия которого на интенсивность регистрируемой биохемилюминесценции представлен на рис. 27.

Рисунок 27. Механизм активации определяемой перекисным окислением липидов (остатков ненасыщенных жирных кислот) биохемилюминесценции биологических образцов в присутствии люминола. При протекании липидной пероксидации всегда генерируются в некотором количестве гидроксильные радикалы ОН^·. Люминол, вступая во взаимодействие с этими радикалами, формирует перекись, образующуюся в электронно-возбужденном состоянии. Затем происходит излучение кванта хемилюминесценции. Поскольку квантовый выход генерации квантов хемилюминесценции у люминола в таких условиях очень высок и намного превышает величину q_хл у возбужденного продукта рекомбинации ROO^· -радикалов, интенсивность биохемилюминесценции увеличивается.

Публикуется с модификациями по: Рощупкин Д.И., Потапенко А.Я., Клебанов Г.И. Практикум по биофизике. Часть 1. Лабораторные работы по спектральным методам исследования и фотобиологии. М.: 1975, с. 178.

.

Формально люминол, значительно увеличивающий интенсивность регистрируемой биолюминесценции, однако, не относится к ее активаторам. Его и подобные ему соединения (например, люцигенин) выделяют в отдельную группу веществ, обозначаемых как хемилюминесцентные индикаторы.

Собственно активаторы и тушители биохемилюминесценции могут быть условно разделены на 2 большие группы. Это химические и физические тушители и активаторы данного вида свечения. Химические активаторы увеличивают скорость генерации возбужденного продукта Р^*₁, а химические тушители ее снижают. Как правило, сами эти соединения в образце постепенно расходуются, из-за чего их концентрация со временем падает. Примером химического активатора связанной с липидной пероксидацией биохемилюминесценции могут служить ионы Fe²⁺ (в концентрации до 10^-5 моль/л), а химического тушителя – липидные антиоксиданты, в частности, a-токоферол.

Физические тушители и активаторы биохемилюминесценции на скорость генерации Р^*₁ не влияют. Механизм их действия на регистрируемую интенсивность данного свечения состоит в том, что их молекулы эффективно перехватывают энергию электронного возбуждения у Р^*₁. Продукт при этом инактивируется, а молекула тушителя или активатора оказывается в возбужденном состоянии. Если собственный квантовый выход излучательных электронных переходов у этой молекулы оказывается выше, чем у Р^*₁, в ее присутствии интенсивность свечения будет увеличиваться – т.е. вещество будет активатором биохемилюминесценции. Если же собственный квантовый выход испускания квантов вторичного излучения у таких молекул меньше, чем у Р^*₁, вещество будет тушителем.

Опишем процессы тушения и активации биохемилюминесценции количественно. Для этого отобразим схему процессов, происходящих в биохемилюминесцирующем образце в присутствии молекул тушителя или активатора.

(1)	2RO2^·® Р^*1 (k6)
(2)	Р^*1®P+hn1 (k1)
(3)	Р^*1®P (k2)
(4)	Р^*1+C®P+C^* или P+C (km)
(5)	С^*®С+hn2 (k1^¢)
(6)	С^*®С (k2^¢)

В этой схеме С – молекулы присутствующего в образце физического тушителя (активатора) биохемилюминесценции, в скобках указаны константы скоростей соответствующих процессов.

Скорость генерации Р^*₁ (V_г) будет равна:

V_г=k₆[RO₂^·]²

В отсутствие тушителя (активатора) С в системе скорость инактивации Р^*₁ (V_и) составит:

V_и=k₁[Р^*₁]+k₂[Р^*₁]

В присутствии тушителя (активатора) скорость инактивации Р^*₁ будет составлять:

V^¢_и=k₁[Р^*₁]+k₂[Р^*₁]+k_m[C][Р^*₁]

В стационарных условиях скорость генерации Р^*₁ должна быть равна скорости его инактивации. По нашему условию добавление в систему тушителя (активатора) не влияет на скорость генерации Р^*₁, поскольку введенное соединение является физическим тушителем (активатором). Таким образом, можно записать:

(105)

V_и=V^¢_и

k₁[Р^*₁]+k₂[Р^*₁]= k₁[Р^*₁]^¢+k₂[Р^*₁]^¢+k_m[C][Р^*₁]^¢,

где [Р^*₁] и [Р^*₁]^¢ - стационарные концентрации возбужденного продукта Р₁ в отсутствие и в присутствии тушителя (активатора) C соответственно.

Введем обозначение:

Использовав его, на основании выражения (105) получим:

(106)

Вспомним, что интенсивность хемилюминесценции в отсутствие тушителя (активатора) равна:

В присутствии же тушителя (активатора) С интенсивность свечения составит:

Величина в последнем выражении – квантовый выход свечения Р^*₁ в присутствии добавки.

Очевидно также, что

Отсюда вытекает, что J_хл=[Р^*₁], а J^¢_хл=[Р^*₁]^¢. Поэтому мы можем записать:

(107)

Выражение (107) по своему виду полностью совпадает с ранее приведенным уравнением Штерна-Фольмера (уравнение (83)). Но при его выводе мы не учитывали, что введенное в образец соединение С после возбуждения может само испускать кванты. Поэтому данное выражение применимо для физических тушителей биохемилюминесценции (у которых собственная люминесценция отсутствует или не регистрируется). Величина К в выражении (107) носит название константы тушения. Напомним, что также называется и аналогичная константа в законе Штерна-Фольмера (уравнение (83)).

Если же возбужденная после столкновения с молекулой Р^*₁ молекула С сама способна с высокой вероятностью испускать кванты излучения, дополнительная интенсивность хемилюминесценции, связанная с присутствием соединения С (J_С), будет составлять:

(108)

В выражении (108) использованы 2 новых обозначения: q_C – квантовый выход люминесценции соединения С, и k - коэффициент эффективности соударений молекул С и Р^*₁, показывающий, какая доля соударений этих молекул приводит к возбуждению молекул С.

Общая же интенсивность хемилюминесценции образца в таком случае будет суммой интенсивностей свечения продукта Р^*₁ и возбужденных молекул С^*:

(109)

Путем ряда алгебраических преобразований выражение (109) можно привести к виду:

(110)

Из анализа выражения (110) можно понять, каким образом присутствие вещества С в образце отразится на общей интенсивности хемилюминесценции этого объекта. Если kq_C будет меньше q_хл (квантового выхода люминесценции Р^*₁), вещество С будет тушителем – интенсивность свечения в его присутствии упадет. При kq_C=q_хл интенсивность регистрируемой хемилюминесценции в присутствии С меняться не будет (но измениться ее спектральный состав). Если же kq_C>q_хл, регистрируемая интенсивность хемилюминесценции J^¢_хл в присутствии С будет больше исходной J_хл, т.е. в таком случае вещество С будет физическим активатором свечения. Для проверки того, является ли активация хемилюминесценции конкретным веществом процессом физическим, или она связана с увеличением скорости генерации Р^*₁ в объекте в его присутствии, удобно привести выражение (110) к следующему виду:

(111)

В выражении (111) постоянная А=kq_C/ q_хл. Экспериментально же она может быть определена из формулы А=J¢_¥/J_хл, где J_хл – интенсивность хемилюминесценции образца в отсутствие С, а J¢_¥ - интенсивность хемилюминесценции объекта в присутствии насыщающей (строго говоря, бесконечно большой) концентрации этого активатора. Из выражения (111) следует, что, если в эксперименте зависимость от концентрации С получается линейной, то вещество С – физический активатор свечения.

Использование физических активаторов позволяет определить, каков характер электронного возбуждения у продукта Р^*₁. Для этого нужно применить такой активатор, для которого известны величины k_m и kq_C. Затем экспериментально (по формуле А=J¢_¥/J_хл) устанавливается величина А, и строится зависимость , из которой определяется величина К (см. выражение (111)). Реальное время жизни Р^*₁ из полученных данных может быть рассчитано по формуле:

Квантовый выход люминесценции Р^*₁ будет равен:

Истинное время жизни Р^*₁ тогда составит:

Если измеренная величина t_и будет порядка 10^-8-10^-9 секунды, продукт Р^*₁ находится в состоянии синглетного возбуждения, а если t_и окажется больше, то излучение квантов происходит с триплетного уровня Р^*₁.

Биохемилюминесценция при активации фагоцитирующих клеток. Как уже упоминалось выше, хемилюминесценция обычна при реакциях, связанных с присутствием свободных радикалов. Вместе с тем, в биологических объектах нередко происходит генерация таких радикалов. Например, свободные радикалы генерируются в митохондриях вследствие работы дыхательной цепи. Более того, имеются клетки, у которых имеются специальные ферменты для продукции радикалов кислорода. Это фагоцитирующие клетки, прежде всего, макрофаги и нейтрофилы. Продукция активных форм кислорода в этих клетках начинается при их активации. Функциональное предназначение такой продукции – инактивация фагоцитированных патогенов и последующее завершение фагоцитоза.

В качестве примера рассмотрим биохемилюминесценцию, наблюдаемую при активации нейтрофилов. Она связана с продукцией в этих клетках при активации супероксидного анион-радикала (). продуцируется вследствие переноса электрона с НАДФ×Н₂ на молекулярный кислород:

Использованный НАДФ×Н₂ затем регенерируется в ходе работы гексозомонофосфатного шунта. Образовавшийся может опосредовать следующие реакции:

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

Реакция (4) в приведенной схеме катализируется специальным ферментом – миелопероксидазой, а реакция (1) резко ускоряется другим энзимом – супероксиддисмутазой (СОД, дисмутазой супероксидных анион-радикалов). Возможность протекания реакции (5) показана в модельных системах, но пока неясно, протекает ли она в нейтрофилах. Эта реакция интересна тем, что в ее ходе продуцируются возбужденные молекулы кислорода (). Напомним, что для этого элемента в невозбужденном состоянии нормальным является расположение электрона на триплетной электронной орбитали, которая в данном случае более выгодна энергетически. При возбуждении же один из электронов в молекуле кислорода переходит на синглетный уровень. Такое состояние молекул О₂ принято называть синглетным кислородом (обозначается, как ¹О₂). Химическая активность у ¹О₂ значительно выше, чем у О₂, поскольку он является молекулой с избытком свободной энергии.

Природа химических реакций в нейтрофилах, обуславливающих продукцию электронно-возбужденных продуктов и генерацию квантов биохемилюминесценции, до сих пор точно не установлена. Имеются только предположения, согласно которым биохемилюминесценция связана с окислением каких-то компонентов клеток перекисью водорода, гидроксильными радикалами ОН^· или гипохлоритом ().

Максимум в спектре биохемилюминесценции у активированных нейтрофилов расположен около 570 нм. Поскольку ее интенсивность обычно мала, из-за чего это свечение трудно регистрировать, для усиления биохемилюминесценции фагоцитов применяются хемилюминесцентные индикаторы, в частности, люминол. В его присутствии интенсивность биохемилюминесценции возрастает в 10-100 раз, а максимум излучения смещается в область 370-500 нм (т.е. в область люминесценции перекисей люминола, см. выше).

Следует отметить, что способность фагоцитирующих клеток к биохемилюминесценции отражает функциональную активность этих клеток. Поэтому ее измерение (обычно в присутствии люминола) применяется в клинике для диагностики, например, скрытых воспалительных процессов в организме пациента или при выявлении нарушений в работе иммунной системы.

---

Дата добавления: 2015-07-25