Реабсорбция фотолюминесценции.

Очевидно, что, перед тем, как выйти из кюветы, каждый квант фотолюминесценции проходит некоторое (большее или меньшее) расстояние внутри объекта. Если же в объекте имеются хромофоры, способные поглощать кванты фотолюминесценции, то часть этих квантов будет поглощена. В результате количество квантов фотолюминесценции, попадающее на фотодетектор и регистрируемое им, снижается. Как следствие, величина J_фл оказывается заниженной, и флуориметрический анализ дает неверные результаты. Описанное событие носит название реабсорбции фотолюминесценции.

Следует заметить, что, в отличие от эффекта экранировки, который всегда связан с присутствием в образце посторонних хромофорных молекул, реабсорбция может наблюдаться и в образце, содержащем только одно соединение. Связано это с тем, что у многих веществ-люминофоров спектр возбуждения фотолюминесценции (близкий по форме к спектру поглощения, см. ниже) и спектр фотолюминесценции перекрываются друг с другом (длинноволновая часть спектра возбуждения фотолюминесценции накладывается на коротковолновый участок спектра фотолюминесценции). Этот вид реабсорбции носит название собственная реабсорбция. В качестве поглощающих кванты фотолюминесценции хромофоров в данном случае выступают сами люминесцирующие молекулы. Другой вид реабсорбции – поглощение квантов фотолюминесценции посторонними соединениями, присутствующими в объекте. Этот вариант носит название примесная реабсорбция.

Заметим, что реабсорбция, как явление, сильнее искажает результаты флуориметрии, чем экранирование возбуждающего света. Если при наличии эффекта экранировки вид спектра фотолюминесценции не меняется (а, следовательно, остаётся возможным решение качественной задачи), то реабсорбция существенно искажает вид регистрируемого спектра флуоресценции. В качестве примера рассмотрим влияние собственной реабсорбции (рис. 20).

l₀

Рисунок 20. Искажение спектра фотолюминесценции при наличии собственной реабсорбции. D – оптическая плотность; J_фл – интенсивность фотолюминесценции; l₀ – длинноволновая граница области поглощения; 1 – спектр поглощения; 2 – истинный спектр фотолюминесценции; 3 – регистрируемый спектр фотолюминесценции. Заштрихован участок спектра фотолюминесценции, подверженный собственной реабсорбции. Пояснения в тесте.

Публикуется с модификациями по: Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: «Дрофа», 2006, с. 55.

На рис. 20 представлены спектр поглощения (кривая 1) и спектр фотолюминесценции (кривая 2) некоторого соединения. Видно, что длинноволновая граница области поглощения данного соединения (l₀) расположена в пределах зоны фотолюминесценции. Это приводит к появлению собственной реабсорбции части квантов фотолюминесценции его молекулами. Если наличие собственной реабсорбции не будет учтено, коротковолновое плечо спектра фотолюминесценции окажется «урезано», и спектрофлуориметр зарегистрирует спектр фотолюминесценции, соответствующий кривой 3. Если же l₀ расположена в более длинноволновой области, чем l_max в спектре фотолюминесценции, т.е. реабсорбируются даже кванты вторичного свечения с длиной волны l_max, может наблюдаться кажущееся (регистрируемое) смещение максимума спектра фотолюминесценции в длинноволновую сторону. Обратите внимание на то, что длинноволновое плечо спектра фотолюминесценции в результате собственной реабсорбции не страдает. Поэтому, если необходимо решение только количественной задачи, для исключения влияния рассматриваемого явления на результат достаточно анализировать зависимость J_фл=f(c) в том спектральном участке фотолюминесценции, где кванты вторичного свечения не реабсорбируются.

В случаях, когда в объекте наблюдается примесная реабсорбция, вид искажения спектра фотолюминесценции определяется видом спектра поглощения реабсорбирующих ее кванты примесей. Поэтому для внесения соответствующих поправок перед измерением спектра фотолюминесценции следует измерить спектр поглощения объекта в той спектральной области, где люминесцирует изучаемое соединение.

Если же необходима регистрация истинного спектра фотолюминесценции, нужно либо принять меры к исключению влияния реабсорбции на этот спектр, либо корректировать уже измеренный спектр свечения с помощью внесения соответствующих поправок.

Из приведенных выше (рис. 19) схем измерения фотолюминесценции наименее чувствительна к искажениям, вносимым реабсорбцией, схема с регистрацией свечения с передней стенки кюветы (рис. 19, В). Недостатком этой схемы является необходимость применения исследуемых веществ в достаточно высоких концентрациях. Но, если это условие выполнено, как уже указывалось выше, при такой схеме будут регистрироваться кванты фотолюминесценции, излученные в тонком слое исследуемого объекта, прилегающем к передней стенке кюветы. Путь, проходимый квантами фотолюминесценции в веществе объекта, оказывается мал, и вероятность их поглощения падает.

Рассмотрим теперь, как можно корректировать уже искаженный реабсорбцией спектр фотолюминесценции. Для этого применяется подход, в принципе аналогичный тому, который применяется при коррекции искажений вследствие экранирования возбуждающего света. Анализируется модель, уже описанная выше, в разделе, посвященном эффекту экранировки. Для такой модели регистрируемая интенсивность фотолюминесценции объема объекта толщиной dx, в условиях, когда реабсорбцией можно было пренебречь, может быть записана в виде:

(62)

Если же часть квантов фотолюминесценции реабсорбируется (оптический путь квантов фотолюминесценции мы принимаем равным оптическому пути квантов возбуждающего света) регистрируемое излучение этого объема окажется ослабленным:

(63)

В выражении (63) e_i и с_i – соответственно молярный коэффициент поглощения и концентрация i -го реабсорбирующего кванты фотолюминесценции компонента объекта.

Со всего образца в условиях реабсорбции будет, таким образом, регистрироваться J^¢_фл следующей величины:

(64)

В уравнении (64) D и D_Р – соответственно оптическая плотность исследуемого вещества (на длине волны возбуждения) и суммарная оптическая плотность всех реабсорбирующих фотолюминесценцию соединений в образце (в области фотолюминесценции).

С учетом того, что в отсутствие реабсорбции должны регистрироваться суммарная интенсивность фотолюминесценции объекта J_фл=kqJ₀(1-10^-D), можно рассчитать поправочный коэффициент на эффект реабсорбции фотолюминесценции (d_Р):

(65)

---

Дата добавления: 2015-07-25