Эффект «сита» как пример неоднородного распределения хромофоров в биологических объектах.

Эффект «сита» (или эффект проскока, как его иногда называют) заключается в существенном занижении измеряемой оптической плотности у клеточных суспензий при небольшой концентрации клеток, если весь хромофор находится в клетках, а межклеточная среда света не поглощает. Он особенно выражен в интенсивных максимумах поглощения. Естественно, поскольку клеточные суспензии обладают еще и светорассеиванием, измерения должны проводиться в таких условиях, когда это явление значимого влияния на величину D_изм не оказывает. Возникает этот эффект в результате того, что при небольшом количестве клеток в суспензии они не в состоянии перекрыть всю освещаемую площадь объекта, и между ними остаются промежутки, через которые излучение проходит без ослабления. Для количественного описания эффекта «сита» введем следующие обозначения:

• J_o – интенсивность падающего на образец излучения;
• J_ч, Т_ч и D_ч – соответственно, интенсивность излучения, выходящего из клетки, светопропускание единичной клетки и ее оптическая плотность на длине волны измерения;
• J_с, Т_с и D_с – величины тех же показателей для клеточной суспензии в целом, измеряемые в эксперименте;
• J, Т и D – аналогичные показатели однородного раствора содержащегося в клетках хромофора при том же его количестве в образце;
• S – освещенная площадь образца;
• L – суммарная площадь поперечного сечения всех клеток, попавших в площадь S (затеняемая клетками площадь);
• r=L/S – доля освещенной площади S, затеняемая клетками.

Выходящий из суспензии световой поток Ф_с= J_с´S будет складываться из потока излучения, прошедшего через клетки (Ф_к = J_ч´L) и потока излучения, прошедшего мимо них (J_o´(S-L)). Т.е. можно записать:

(44)

Разделив обе части выражения (44) на падающий поток J_oS, определим Т_с:

(45)

Теперь перейдём от пропускания к оптической плотности:

(46)

Для сопоставления оптической плотности раствора хромофора D с оптической плотностью суспензии D_с вспомним, что из условия эквивалентности раствора суспензии по количеству хромофора вытекает, что:

Поэтому можно записать, что:

(47)

Из уравнения (47) видно, что при r= 1 D_с становится равным D. Если же r<< 1, можно разложить правую часть выражения (47) в ряд Тейлора по степеням r, ограничиваясь двумя членами разложения:

(48)

Поскольку D_ч – оптическая плотность единичной клетки, можно предположить, что она также мала и разложить в ряд Тейлора числитель в правой части выражения (48) по степеням D_ч. Первую скобку числителя раскладываем до второго члена, а вторую – только до первого. После сокращений получим:

(49)

Проанализируем выражение (49). Из него вытекает, что различия между D_с и D возрастают при увеличении D_ч и снижении r. Поскольку D_ч определяется тем же, хромофором, что и D, в максимумах его поглощения разница между D_с и D будет велика, а минимумах – относительно мала. Кроме того, чем ниже будет концентрация клеток в суспензии (чем меньше r), тем сильнее будет сказываться эффект «сита» при спектрофотометрии.

Иногда, впрочем, специально анализируется величина эффекта «сита» в клеточных суспензиях. Её измерение позволяет вычислить такие важные показатели клеток, как их размер и концентрацию, а также количество хромофора в клетке.

Из выражения (49), в частности, следует, что:

Можно измерить DD при двух длинах волн тестирующего излучения, l₁ и l₂. Тогда получим систему уравнений:

(50)

Индексы l₁ и l₂ указывают на значения соответствующей оптической плотности при длине волны тестирующего излучения l₁ и l₂. Поскольку хромофор в растворе и в клеточной суспензии один и тот же, и его концентрация одинакова в обоих образцах, можно записать следующее соотношение:

,

где и - значения молекулярных коэффициентов поглощения хромофора при длине волны тестирующего излучения l₁ и l₂. Обозначим величину как А, и введем это обозначение в систему (50):

(51)

Система уравнений (51) содержит только 2 неизвестных величины - r и - и, следовательно, имеет однозначное решение. Вспомним, что r=L/S, а L может быть выражена, как L=S_чN, где S_ч – площадь поперечного сечения единичной клетки, а N – количество клеток в освещенном объеме образца (V_изм=Sl). Зная S и N, можно определить S_ч. Если же известны S_ч и D_ч, можно рассчитать количество (массу) хромофора в единичной клетке:

(51)

В уравнении (51) m – масса хромофора в единичной клетке, выраженная в молях, e - молярный коэффициент поглощения этого хромофора на длине волны измерения D_ч, V – объем клетки в л, S_ч – площадь ее поперечного сечения в дм²; l – оптический путь, который в данном случае принимается равным толщине клетки в направлении прохождения света, выраженный в дм.

Дата добавления: 2015-07-25