Количественный спектрофотометрический анализ.

Количественный фотометрический анализ, т.е. определение количества хромофорных молекул в образце или их концентрации, основан на применении закона Бугера-Ламберта-Бера. Для того, чтобы этот закон мог быть использован, необходимо, чтобы во время измерения были соблюдены все условия его выполнения (см. раздел 2.2).

Определение концентрации хромофорных молекул в объекте возможно, если для данного соединения точно известна величина молярного коэффициента поглощения (e) на той длине волны излучения, на которой проводятся измерения оптической плотности. Если величина e неизвестна, ее можно измерить экспериментально, построив зависимость оптической плотности от концентрации определяемого вещества (используемого в чистом виде) в образце. Из закона Бугера-Ламберта-Бера вытекает, что эта зависимость должна быть линейной, а коэффициент пропорциональности между D и концентрацией хромофора в объекте есть произведение e на оптический путь (l).Если же измерения проводятся при величине l =1 см, коэффициент пропорциональности между D и концентрацией хромофора будет равен величине e данного хромофора на длине волны измерения. Следует заметить, что величина e, измеренная по величинам D на данной длине волны в растворах определяемого хромофора в чистом виде, не всегда соответствует величине этого показателя в реальном объекте. Достаточно часто влияние окружения хромофорных молекул в сложных объектах приводит к некоторому смещению полос их поглощения и, соответственно, изменению величины e при фиксированной длине волны тестирующего излучения. Для исключения возможных ошибок перед проведением количественного определения концентрации конкретного хромофора следует измерить спектр поглощения объекта в области поглощения этого соединения, чтобы убедиться в том, что максимумы его поглощения не смещены по сравнению с раствором данного вещества в чистом виде.

Измерения оптической плотности образца с целью определения концентрации того или иного хромофора в нем проводятся на специальных оптических приборах – фотометрах. Если фотометр позволяет регистрировать не только величину D при конкретных длинах волн тестирующего излучения, но делает возможным и измерение спектров поглощения образца в различных спектральных диапазонах, то это – спектрофотометр.

Как и любое другое измеряющее устройство, фотометр измеряет величину D с определенной ошибкой (т.е. конечной точностью). Ошибки при измерении D можно разделить на кюветные и приборные.

Кюветные ошибки наиболее значимы. Их появление связано с тем, что при определении D чаще всего величины светового потока через исследуемый образец (F) и образец сравнения (F₀) измеряются с использованием разных кювет, помещаемых в тестирующий пучок излучения по очереди. Иногда используется одна кювета, но для замены образца её извлекают из прибора. Вместе с тем, идеально одинаковых кювет для измерений не бывает, а при повторной установке кюветы в тестирующий пучок излучения, этот пучок, как правило, попадает на несколько другое ее место. Вследствие всего этого условия измерения F и F₀ оказываются различными, из-за чего и возникает ошибка определения D.

Для минимизации величины кюветной ошибки удобно применять жестко фиксированные в тестирующем луче кюветы, образец в которых можно заменить без их извлечения из фотометра. К сожалению, промывка таких кювет от остатков образцов бывает достаточно сложна технически.

Возникновение приборной ошибки связано с неидеальностью фотометра как измерительного устройства. В частности, пучок тестирующего излучения всегда не строго монохроматичен (если, конечно, в качестве источника этого излучения не применен лазер), а имеет определенную спектральную ширину. Точность выбора длины волны тестирующего излучения конечна. Яркость источника излучения всегда в той или иной степени варьирует во времени. Наконец, фотодетектор (устройство для регистрации излучения) всегда обладает собственными шумами, которые влияют на точность измерений F и F₀. Поскольку величина регистрируемого фотодетектором светового сигнала зависит от D, точность измерения F падает при слишком больших и слишком малых значениях D образца.

Определим величину D, при которой относительная ошибка измерения оптической плотности () минимальна.

Для этого требуется найти минимум функции .

Абсолютная ошибка измерения (DD)величины D, которая является функцией переменной F, будет равна произведению первой производной функции, описывающей зависимость D от F, на абсолютную ошибку измерения F (DF). По определению:

(26)

Теперь возьмём 1-ю производную зависимости (26) и приравняем её 0:

(27)

Решив уравнение (27) относительно D, получим D = 0,4343. Это и есть величина оптической плотности образца, при которой приборная ошибка измерения будет минимальна. Эта ошибка увеличивается не очень сильно, если D находится в интервале от 0,2 до 0,8, но резко нарастает при выходе за пределы данного интервала.

Для выделения тестирующего излучения с нужной длиной волны из излучения источника в спектрофотометрах применяются специальные оптические устройства – монохроматоры. Мы не будем здесь останавливаться на типах и особенностях этих устройств подробно. Однако следует заметить, что все они пропускают часть излучения источника без монохромирования. Эта примесь белого (т.е. полихроматического) света, выходящая из монохроматора и попадающая на объект, носит название блуждающий свет. Причиной её появления является неидеальность реальных монохроматоров, из-за которой не все попавшее в них излучение проходит по нужному оптическому пути. Поскольку блуждающий свет немонохроматичен, он не поглощается (или поглощается очень слабо) исследуемым объектом и попадает на фотодетектор практически без ослабления. В результате измеренная оптическая плотность оказывается искаженной. Рассмотрим, как влияет примесь блуждающего света на результаты фотометрии.

Пусть F_бл – поток блуждающего света, попадающий на образец, а F и F₀ – потоки падающего и выходящего из него монохроматического тестирующего излучения. Тогда измеряемая величина оптической плотности D_изм будет равна:

Разделим все значения потоков в правой части уравнения на F₀:

Вспомним, что логарифм частного равен разности логарифмов числителя и знаменателя:

(28)

Проанализируем полученное выражение (28). Из него вытекает, что ошибка измерения D будет зависеть не столько от абсолютной величины потока блуждающего света, сколько от отношения , т.е. от доли этого света в падающем на образец излучении. Если доля мала (), первый логарифм в правой части уравнения (28) превращается в величину искомой оптической плотности, а второй становится равен 0. Т.е. в такой ситуации D_изм® D. Если же значительно больше 0, то и ошибка измерения оптической плотности будет весьма большой.

Следует отметить, что не существует источников излучения с бесконечно широкой в спектральном плане областью испускания. Область доступных длин волн тестирующего излучения в каждом спектрофотометре ограничена и лимитируется спектром испускания установленных в нем источников излучения. Если измерения D проводятся на тех длинах волн, где используемый источник света дает много, величина F₀ будет велика, а отношение - мало. Соответственно, мала будет и ошибка измерения оптической плотности. Но при измерении D в тех спектральных интервалах, которые близки к границам области испускания источника излучения (F₀ мало), отношение может стать недопустимо большим, поскольку величина F_бл вообще не зависит от той длины волны, на которую настроен в данный момент монохроматор спектрофотометра. В такой ситуации ошибка измерения D будет очень велика.

Спектрофотометрический анализ позволяет определить не только концентрацию одного конкретного хромофора. С его помощью можно рассчитать и концентрации нескольких хромофорных соединений в смесях. Правда, это осуществимо при условии, что определяемые хромофоры в смеси не образуют комплексов с другими молекулами и друг с другом. В противном случае спектры их поглощения могут оказаться измененными, и приводимые ниже расчеты дадут неправильный результат.

В разделе 2.1 указано, что хромофорные молекулы в смесях поглощают свет независимо друг от друга, а суммарная оптическая плотность смеси равна сумме оптических плотностей находящихся в ней хромофоров (см. уравнение (23)). Это справедливо для всех длин волн тестирующего излучения. Поэтому в присутствии в образце двух хромофоров можно измерить величины D образца при двух длинах тестирующего излучения. Полученные значения D при l₁ и l₂ будут соответствовать уравнениям:

где и - величины молярных коэффициентов поглощения хромофоров 1 и 2 в смеси при l₁, и - величины этих же коэффициентов при l₂, с₁ и с₂ –искомые концентрации хромофоров.

Если измерения проводятся в кювете с величиной оптического пути (l) 1 см, то полученная система уравнений ещё более упростится:

В полученной системе из 2-х уравнений имеется 2 неизвестные величины - с₁ и с₂. Следовательно, имеется однозначное решение. Правда, для решения требуется, чтобы величины молярных коэффициентов поглощения для обоих хромофоров при обеих длинах волн тестирующего излучения были известны. Нужно заметить, что чаще всего у хромофора бывают известны величины e только в максимумах поглощения. В такой ситуации измерять , , , и приходится в отдельном эксперименте. Важно также, чтобы поглощение света образцом при l₁ и l₂ определялось только выявляемыми хромофорами.

Таким же путем можно установить и концентрации большего числа хромофоров в объекте. Правда, при этом количество длин волн тестирующего излучения, при которых измеряется D, должно соответствовать числу хромофоров, концентрации которых требуется определить.

Выше уже указывалось, что полосы поглощения хромофоров в биологических объектах характеризуются значительной полушириной (Dl_1/2 обычно составляет несколько десятков нанометров). На практике это означает, что полосы поглощения отдельных хромофоров, если их максимумы не очень далеки друг от друга, сильно перекрываются. Следовательно, бывает трудно найти такую длину волны тестирующего излучения l, при которой все поглощение объекта определялось бы только одним хромофором. Вместе с тем, если не учесть вклад в величину измеряемой D при данной l поглощения всех присутствующих в объекте хромофоров, обладающих способностью к поглощению излучения с этой длиной волны, определение концентрации одного из них по закону Бугера-Ламберта-Бера даст заведомо ложный результат.

Можно привести следующий пример подобной ошибки, к сожалению, достаточно часто встречающийся.

Спектрофотометрия – один из весьма распространенных методов оценки количества продуктов перекисного окисления ненасыщенных жирнокислотных остатков в биологических образцах. Количество таких продуктов позволяет оценить степень окисления биологически значимых молекул и, соответственно, тяжесть окислительного стресса в клетках и тканях. Основным продуктом окисления ненасыщенных жирных кислот, количество которого определяется спектрофотометрически, является малоновый диальдегид (МДА). Для того, чтобы поглощение этого соединения было значительным (его концентрации в биологических образцах очень невелики), проводится обработка образца 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК), агентом, образующим с МДА прочный комплекс с высоким значением e в видимой области спектра. Максимум поглощения этого комплекса в водных растворах приходится на 532 нм. К сожалению, можно увидеть работы, в которых количество МДА в биологическом объекте после его обработки ТБК оценивается путем измерения D при 532 нм и последующего прямого расчета концентрации МДА (с_МДА) по уравнению D₅₃₂=e_МДА(532)с_МДАl. Такой подход был бы оправдан, если бы МДА был единственным веществом в образце, образующем поглощающий свет комплекс с ТБК. К сожалению, это не так – 2-тиобарбитуровая кислота образует окрашенные комплексы со всеми альдегидами, имеющимися в образце. В биологических же объектах сложного состава альдегидных групп много. В частности, часть молекул глюкозы, например, пребывает в форме альдегида и способна образовывать окрашенный комплекс с ТБК (максимум поглощения при 550 нм). К чему приводит определение количества комплексов ТБК-МДА в образце путем измерения только D₅₃₂ , показано на рис. 5.

Рисунок 5. Спектр поглощения водного экстракта биологического образца после его обработки 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК). На спектре выявляются три полосы поглощения, при 450, 532 и 550 нм, определяемые комплексами ТБК соответственно с моноальдегидами, малоновым диальдегидом (МДА) и моносахарами (например, глюкозой). Пунктирными линиями показаны невидимые на спектре «плечи» этих полос поглощения. Вследствие перекрывания полос оптическая плотность образца при 532 нм (D₅₃₂) будет суммой оптических плотностей при данной длине волны всех трёх типов ТБК-комплексов. При определении концентрации комплекса ТБК с малоновым диальдегидом (МДА) только по величине D₅₃₂ с последующим использованием закона Бугера-Ламберта-Бера рассчитанное количество этого комплекса окажется сильно завышенным. Если же по тем или иным причинам (например, из-за заболевания пациента, у которого получен исследуемый биологический материал) в образце увеличено содержание моносахаров и/или моноальдегидов, ошибка определения содержания комплекса ТБК-МДА еще более возрастет.

Обозначения на рис.: – оптическая плотность при 532 нм комплекса ТБК с моноальдегидами; – оптическая плотность при 532 нм комплекса ТБК с МДА; – оптическая плотность при 532 нм комплекса ТБК с моносахарами.

В ситуации, аналогичной той, которая представлена на рис. 5, когда поглощение выявляемого соединения вносит только незначительный вклад в общее поглощение света образцом, часто, к сожалению, не представляется возможным оценить точно концентрацию этого вещества в объекте, поскольку величины D для других хромофоров на длине волны измерения неизвестны. В таких случаях следует проводить измерения D при тех длинах волн, где все ослабление света в объекте связано только его поглощением выявляемым веществом. Если же и это невозможно, можно применить способ обсчета спектра поглощения, позволяющий определить относительную величину количества искомого хромофора.

Схема такого обсчета приведена на рис. 6.

D_max

DD_max

l_max

D

D(l₂)

D(l₁)

l, нм

Рисунок 6. Схема расчета показателя DD_max в случаях, когда определяемый хромофор – не единственное соединение, поглощающее при длине измерения Если искомый хромофор имеет в спектре поглощения максимум при l=l_max, но при этой же длине волны поглощают свет другие хромофоры, мешающие точно измерить концентрацию определяемого вещества, можно рассчитать величину DD_max, пропорциональную концентрации искомого хромофора. Для этого, помимо D в максимуме спектра поглощения искомого вещества (D_max) измеряются величины D образца при длинах волн l₁ и l₂. При этом требуется, чтобы l_max - l₁ = l₂ - l_max. DD_max в таком случае может быть рассчитано по формуле:

Измеряемая таким образом величина DD_max пропорциональна искомой концентрации хромофора, но коэффициент пропорциональности в данном случае неизвестен. Соответственно, определяется только относительная концентрация. Однако, если определяемый хромофор имеется в чистом виде, то, добавляя его в известном количестве в образец, можно получить зависимость DD_max = f(c) (где с – добавленная концентрация определяемого соединения). С помощью этой зависимости можно уже точно измерить количество искомого вещества в исследуемом объекте.

Дата добавления: 2015-07-25