Анализ величины светорассеивания как метод изучения биологических объектов

При исследовании процессов, протекающих в биологических объектах, часто возникают ситуации, при которых истинное поглощение света в объекте не изменяется, тогда как его способность рассеивать оптическое излучение изменяется весьма значительно. Примерами подобного рода ситуаций могут служить агрегация клеток, изменение их формы и размера, или их лизис. В ходе указанных процессов изменения количества хромофоров в объекте, как правило, не происходит. Соответственно, способность объекта поглощать оптическое излучение не меняется. Однако все эти процессы сопровождаются изменением количества и формы оптических неоднородностей (т.е. рассеивающих центров) в объекте и, следовательно, изменением в его способности рассеивать свет. Для исследования характеристик таких процессов удобно специально оценивать величину светорассеивания в них. Для измерения выраженности светорассеивания применяются 2 принципиально различающихся приёма, турбодиметрия и нефелометрия (рис. 1).

При турбодиметрии схема измерения световых потоков, выходящих из объекта, принципиально такая же, как и при обычной фотометрии (рис. 14А): определяется величина потока излучения, выходящего из объекта без светорассеивания (т.е. не рассеянного или прямо проходящего излучения). Ясно, что при такой схеме измерения измеряемый световой поток будет тем меньше, чем сильнее светорассеивание в объекте. Для повышения чувствительности измерений в приборах, которые предназначены для турбодиметрии (турбодиметрах), как правило, специально ограничивается телесный угол светосбора фотодетектора. Достигается это за счет расположения кюветы с образцом далеко от этого детектора и с помощью установки специальной диафрагмы, ограничивающей выходную (а иногда – и входную) апертуру кюветного отделения (рис. 14А). Поскольку в областях спектра, где исследуемый объект способен еще и поглощать излучение, зависимость между поглощением света и его рассеиванием носит сложный характер, то для упрощения оценки результатов при измерениях светорассеивания чаще всего применяется излучение, кванты которого объектом заведомо не поглощаются. Для биологических объектов это красное видимое и ближнее инфракрасное излучение (650-900 нм). В таких условиях все регистрируемое ослабление проходящего прямо (не рассеянного) излучения будет определяться только собственно рассеиванием.

Нефелометрия (рис. 14Б) основана на анализе потоков рассеянного излучения, выходящих из объекта. Для того, чтобы сделать это, фотодетектор в нефелометрах (приборах, предназначенных для нефелометрии) располагается таким образом, чтобы не рассеянное излучение на него не попадало, т.е. под некоторым углом b к направлению освещения объекта (рис. 14Б). Во многих нефелометрах предусмотрена возможность изменения угла b. В результате можно получать зависимость интенсивности рассеянного излучения (J_pc) от b. Зависимость J_pc=f(b) носит название индикатрисса рассеивания. Из ее анализа можно получить много полезной информации об ориентации, форме и некоторых других свойствах рассеивающих центров (в клеточных суспензиях ими являются собственно клетки). При b =0^о нефелометрия трансформируется в турбодиметрию. Поскольку при нефелометрии измеряется поток рассеянного излучения, измеряемая величина нарастает по мере усиления рассеивания света в объекте.

J_пп

Рисунок 14. Турбодиметрическая (А) и нефелометрическая (Б) схемы измерения величины светорассеивания в биологических объектах. J_o – падающее излучение; J_pc – рассеянная компонента выходящего излучения; J_пп – не рассеянная (прямо проходящая) компонента выходящего излучения; b - угол между направлением освещения объекта и направлением регистрации выходящего излучения; ФД - фодетектор; К – кювета с образцом; Д – диафрагма, ограничивающая поперечное сечение измеряемого пучка излучения.

Поскольку турбодиметрические измерения технически проще, чем нефелометрические, а получаемой с их помощью информации часто оказывается достаточно для оценки исследуемого процесса, турбодиметрия распространена шире, чем нефелометрия.

При турбодиметрическом анализе светорассеивания тех типов, которые наблюдаются в клеточных суспензиях, в определенном интервале концентраций рассеивающих центров (т.е. клеток) выполняется закон Бугера-Ламбера-Бера:

,

где:

• J_пп – интенсивность (или поток) не рассеянного (проходящего прямо) излучения;
• J_o – интенсивность (или поток) падающего излучения
• К – константа, величина которой зависит от условий измерения и свойств объекта (см. ниже);
• С – концентрация рассеивающих центров (в клеточных суспензиях – обычно клеток или их агрегатов);
• l – длина оптического пути.

В приведенной формуле вместо молярного коэффициента поглощения применяется константа К. Нужно заметить, что К будет константой только для данного конкретного турбидиметра в данных конкретных условиях измерения, т.к. величина этого показателя зависит от телесного угла светосбора g, формы и размера рассеивающих центров, типа светорассеивания (при многократном рассеивании закон Бугера-Ламберта-Бера перестает выполняться) и многих других параметров. Величину К для данного, конкретного, типа объекта, и данного, конкретного турбидиметра, определяют экспериментально. К другим объектам, анализируемым на этом же приборе, и даже к самому исследованному объекту при его измерениях его светорассеивания на других турбидиметрах, измеренная величина К уже неприменима.

Турбодиметрический принцип измерения светорассеивания используется в большинстве оптических агрегометров, предназначенных для анализа агрегации клеток (например, тромбоцитов) и активно используемых в практической медицине. Методом тубодиметрии удобно также анализировать ряд процессов, сопровождающихся лизисом клеток или выходом из них цитоплазматического содержимого в среду инкубации, например, исследовать гемолиз.

В заключение этой главы необходимо также упомянуть об еще одном типе светорассеивания, которое наблюдается в биологических объектах. Это так называемое комбинационное или рамановское рассеивание. Принято считать, что при светорассеивании не происходит изменения энергии квантов, поэтому рассеянное излучение имеет те же спектральные характеристики, что и падающее. На самом деле в ходе взаимодействия с молекулами образца, которые находятся в состоянии теплового движения (обладают колебательной и вращательной компонентами внутренней энергии) у части квантов рассеянного света энергия изменяется. Величина этого изменения намного меньше, чем в случаях индукции ими электронных переходов между орбиталями, но вполне измерима при освещении объекта строго монохроматическим источником света (например, лазером). Для определения величины такого рассеивания анализируется спектральный состав рассеянного излучения. Если падающее на образец излучение было монохроматичным, на этом спектре комбинационного рассеивания можно увидеть расположенные симметрично относительно длины волны падающего на объект света, но смещенные в длинно- и коротковолновую стороны максимумы, так называемые «красные» и «синие» спутники.

Квантово-механические причины появления этих спутников состоят в том, что при соударении с молекулой рассеиваемый квант может либо приобрести часть ее тепловой энергии (молекула в результате ее потеряет), либо, напротив, часть ее потерять (молекула в результате ее приобретает). Электронные межорбитальные переходы при этом не наблюдаются, но меняются колебательные и вращательный компоненты внутренней энергии молекулы.

Спектры комбинационного рассеивания активно применяются для исследования, например, вторичной структуры белковых молекул, поскольку части таких молекул, находящиеся в форме a-спирали, дают максимум на таком спектре, отличающийся от максимума, связанного с доменами в форме b-складчатой структуры.

Дата добавления: 2015-07-25