Светорассеивание и его влияние на результаты спектрофотометрического анализа.

Определение 15:

Светорассеиванием называется любое отклонение квантов излучения в веществе объекта от первоначального направления распространения, если переизлучение фотонов молекулами осуществляется быстрее, чем за 10^-12 секунды.

Если взаимодействие кванта излучения с молекулой-хромофором при поглощении можно рассматривать как неупругое столкновение, приводящее к исчезновению кванта, то при светорассеивании столкновение молекулы и кванта – почти упругое, т.е. фотон молекулой не поглощается. Все взаимодействие электронов и кванта при этом затрагивает только колебательные и вращательные энергетические подуровни, а межорбитальные электронные переходы не наблюдаются. Поскольку при таком характере взаимодействия размениваемые порции энергии очень невелики, сам процесс переизлучения очень короток.

На макроуровне причиной светорассеивания является присутствие в образце так называемых оптических неоднородностей, областей, в которых коэффициент преломления отличается от среднего по объекту. Преломление света на таких неоднородностях и его отражение от их границ – основные причины светорассеивания (рис. 9).

В биологических исследованиях наиболее часто встречающимся объектом, обладающим выраженным светорассеиванием, являются суспензии клеток в водных средах инкубации. Роль оптических неоднородностей здесь выполняют сами клетки – коэффициент преломления у клеточной цитоплазмы значительно выше, чем у окружающей клетки водной среды.

При определении оптической плотности светорассеивающего образца часть

Рисунок 9. Схема, поясняющая причины рассеивания света в присутствии оптических неоднородностей в образце. При коэффициенте преломления внутри неоднородностей n_ч, большем, чем средний коэффициент преломления по образцу n, оптическое излучение, попавшее на эти неоднородности, будет либо преломляться (1), либо отражаться (2). В любом случае направление распространения квантов измениться – произойдет светорассеивание. То же самое будет наблюдаться и если n_ч будет меньше n.

рассеянных квантов излучения, если не предпринять специальных мер, не попадёт на фотодетектор спектрофотометра и не будет регистрироваться. В результате измеренная величина F окажется заниженной, а измеренная величина оптической плотности (D_изм) – завышенной (рис. 10).

		А.
		Б.

Рисунок 9. Схема, поясняющая причины увеличения измеряемой оптической плотности при наличии светорассеивания в образце. Если светорассеивание в образце отсутствует (А), выходящий из него световой пучок J остаётся таким же параллельным, как и падающий на образец тестирующий пучок J₀. Если в образце имеется светорассеивание (Б), выходящий пучок J становится расходящимся, и составляющие его кванты находятся в пределах некоторого телесного угла (на рисунке обозначен овалом). Часть квантов пучка J при этом отклоняется настолько сильно, что не попадает на фотодетектор спектрофотометра (ФД). Эти кванты не регистрируются и воспринимаются прибором, как поглощенные. Измеряемая оптическая плотность существенно завышается по сравнению с истинной.

Помимо указанного увеличения D_изм, светорассеивание может повлиять и на истинное значение оптической плотности объекта. Дело в том, что при большом количестве оптических неоднородностей в образце кванты, проходя через него, могут изменить направление своего распространения несколько раз. Такая ситуация называется многократным светорассеиванием. В результате многократного светорассеивания фотоны двигаются в веществе образца по сложной ломаной траектории, проходя при этом расстояние, значительно превышающее толщину кюветы. Вместе с тем, напомним, что величина l в законе Бугера-Ламберта-Бера – это оптический путь, т.е. расстояние, проходимое светом в веществе образца. Увеличение l из-за многократного светорассеивания неизбежно приводит к росту оптической плотности объекта. В результате расчет концентрации хромофоров по закону Бугера-Ламберта-Бера дает завышенный результат.

Многократное светорассеивание – наиболее «неприятный» из оптических феноменов, мешающих проведению спектрофотометрических измерений. Дело в том, что устранить увеличение оптического пути с помощью приборных приставок или теоретических поправок невозможно, поскольку количество актов рассеивания квантов в объекте, как правило, неизвестно. Более того, чаще всего это количество индивидуально для каждого из проходящих через такой объект фотонов. Поэтому единственным способом ухода от искажений в величине D_изм из-за многократного светорассеивания и увеличения оптического пути является модификация образца, направленная на сведение многократного светорассеивания к однократному. Этого можно достичь, либо снизив концентрацию оптических неоднородностей (например, клеток) в объекте, либо, если это нежелательно, проводя измерения в очень тонкой кювете.

Но и однократное светорассеивание существенно искажает результаты как количественного, так и качественного спектрофотометрического анализа. Качественный анализ оказывается осложнен из-за того, что степень отклонения квантов от исходного направления распространения в образце вследствие рассеивания зависит от длины волны тестирующего излучения. В первом приближении (см. ниже) можно считать, что величина светорассеивания обратно пропорциональна этому показателю. Поскольку при регистрации спектра поглощения рассеивающего свет объекта на каждой длине волны тестирующего излучения измеряется сумма ослаблений света в объекте из-за истинного поглощения и светорассеивания, полученный спектр также будет суммой спектров истинного поглощения и светорассеивания. Естественно, вид его будет сильно искажён, и решение качественной задачи станет невозможным.

Сильные искажения, вносимые в результаты спектрофотометрического анализа светорассеиванием, привели к разработке ряда приемов, позволяющих правильно измерять величину истинного поглощения в мутных (т.е. рассеивающих свет) объектах. Условно эти приемы можно разделить на 3 группы:

(1) воздействия на изучаемый объект, направленные на снижение светорассеивания в нём;

(2) применение специальных приборных приставок (приспособлений), позволяющих правильно измерить истинную величину оптической плотности мутного объекта;

(3) коррекция уже измеренных искаженных светорассеиванием спектров поглощения с помощью специальных методов обсчета.

Рассмотрим эти приемы подробнее.

Дата добавления: 2015-07-25