Разностная (дифференциальная) спектрофотометрия

Как уже неоднократно указывалось выше, биологические объекты отличаются сложным составом и обычно содержат много типов хромофорных молекул. Из-за этого нередко вклад в общую оптическую плотность образца поглощения какой-либо молекулы одного типа оказывается мал. При этом плохое разрешение спектров поглощения биологических образцов делает невозможным выбор такой длины волны тестирующего излучения, при которой вся измеряемая оптическая плотность была бы связана с конкретным хромофором. Вместе с тем, часто необходимо бывает исследовать изменения в образце, затрагивающие только молекулы одного, конкретного, типа. Например, может потребоваться регистрация сдвигов в окислительно-восстановительном статусе цитохрома с в составе митохондриальных мембран, а вклад поглощения этого цитохрома в общее ослабление света в видимой области спектра митохондриальной суспензией незначителен.

В подобных случаях можно прибегать к приёму, который называется разностной или дифференциальной спектрофотометрией. Суть метода в том, что в качестве образца сравнения (величина светового потока через который принимается за F₀) при регистрации спектра поглощения объекта используется не просто кювета c растворителем, а такой же, как и исследуемый, образец, но до воздействия на него модифицирующим изучаемое вещество воздействием. В этом случае поглощение всех веществ объекта, которые модифицирующему воздействию подвержены не были, будет принято прибором за 0, а регистрироваться будут только те изменения в спектре поглощения, которые произошли в результате модификации.

Примером применения подобного подхода может быть известный метод выявления тирозиновых остатков в белках.

Тирозин, будучи производным фенола, является слабой кислотой, диссоциирующей при щелочных рН (отщепляется протон от гидроксильной группы). Поэтому для выявления присутствия тирозиновых остатков в исследуемом белке достаточно зарегистрировать спектр поглощения в ультрафиолетовом спектральном диапазоне его раствора в среде с рН³13, используя в качестве образца сравнения такой же раствор, но в среде с рН около 7. Если в полипептидной цепи исследуемого белка имеются тирозиновые остатки, на полученном разностном спектре поглощения будет иметься максимум около 290 нм, связанный с появлением в щелочной среде тирозинат-аниона. Поглощение же других аминокислотных остатков при увеличении рН меняется слабо и на вид разностного спектра значимого влияния оказывать не будет.

Следует заметить, что применение разностной спектрофотометрии улучшает точность измерения оптической плотности. Данные, указывающие на это, приведены на рис. 8.

Рисунок 8. Зависимость среднеквадратичной ошибки (s, %) спектрофотометрического анализа от величины регистрируемой оптической плотности (D_р) при обычном варианте регистрации (кривая 1) и разностной спектрофотометрии (кривая 2 – оптическая плотность образца сравнения 0,25; кривая 3 – оптическая плотность образца сравнения 2,0). Обратите внимание, что ошибка измерения оптической плотности особенно низка в тех случаях, когда D_р мала, а оптическая плотность образца сравнения – велика (ср. кривые 2 и 3).

Публикуется с модификациями по: Бабко А.К., Пилипенко А.Т. Фотометрический анализ. М.: «Химия», 1968, с. 231-238.

Поскольку при разностной спектрофотометрии регистрируется разность оптических плотностей объекта (D_об) и образца сравнения (D_ср), т.е. меряется DD=D_об – D_ср, значения измеряемого показателя DD могут быть и отрицательными (при обычной спектрофотометрии величина D не может быть отрицательной по определению, см. уравнение (18)). В случае, если применяемый спектрофотометр не позволяет регистрировать отрицательные значения D, для регистрации разностных спектров поглощения в спектральных участках, где DD отрицательна, требуется поменять кюветы с исследуемым объектом и образцом сравнения в кюветном отделении прибора местами.

Разностная спектрофотометрия позволяет успешно решать не только качественные, но и количественные задачи. Для решения количественной задачи, однако, требуется знание дифференциального коэффициента поглощения (e_диф), который обычно определяется в отдельном эксперименте, путем воздействия модификатором на исследуемый хромофор в чистом виде. Если e_диф известен, то концентрация хромофора (с) в образце может быть рассчитана по формуле:

Дата добавления: 2015-07-25