Влияние окружения люминесцирующих молекул на параметры фотолюминесценции. Флуоресцентные зонды и метки.

Поскольку электронно-возбужденное состояние для молекул является термодинамически неустойчивым, возбужденные молекулы сильнее реагируют на изменения в окружении, чем невозбужденные. Наибольшее влияние на них оказывают такие показатели, как полярность близ расположенных молекул, их подвижность, диэлектрическая проницаемость среды.

Рассмотрим возможные сдвиги в характере фотолюминесценции при изменении диэлектрической проницаемости среды. Напомним, что относительная диэлектрическая проницаемость (будем здесь обозначать ее E) – физическая величина, показывающая, насколько сила взаимодействия двух единичных электрических зарядов в данной среде меньше, чем в вакууме. Относительная диэлектрическая проницаемость, по определению, величина безразмерная.

Каждая молекула в каждый конкретный момент времени является диполем (у которого «+» - суммарный заряд ядер, а «-» - суммарный заряд электронов). Как и любой другой диполь, молекула, таким образом, может быть охарактеризована величиной дипольного момента. Поскольку и ядра, и электроны в молекуле смещаются друг относительно друга из-за тепловых колебаний, величина дипольного момента молекулы во времени постоянно варьирует. Такие диполи принято называть осциллирующими. При электронном возбуждении среднее расстояние между электронами и ядрами в молекуле возрастает. Соответственно, значимо увеличивается и дипольный момент такой молекулы. Иными словами, возбужденная молекула – обычно более сильный диполь, чем невозбужденная. При пребывании в полярном растворителе такой диполь вызовет формирование вокруг себя слоя ориентированных соответствующим образом дипольных молекул растворителя. К чему это приводит, представлено на рис. 21.

Рисунок 21. Сдвиги в электронных энергетических уровнях молекулы при ее перемещении из неполярного (I) в полярный (II) растворитель. Пояснения в тексте. Публикуется с модификациями по: Рощупкин Д.И., Потапенко А.Я., Клебанов Г.И. Практикум по биофизике. Часть 1. Лабораторные работы по спектральным методам исследования и фотобиологии. М.: 1975, с. 21.

При помещении молекулы-диполя в полярный растворитель происходит взаимодействие дипольных моментов самой молекулы и дипольных моментов окружающих ее молекул растворителя. Обозначим величину дипольного момента у рассматриваемой молекулы в основном состоянии m⁰, а в возбужденном - m^*. Пусть m^* будет больше m⁰. В ходе ориентации молекул растворителя и формирования вокруг растворенного молекул соединения сольватационных оболочек в этих молекулах происходит смещение вниз по величине энергии основного электронного уровня S⁰. Величина этого сдвига соответствует энергии сольватации Е₀. Изменяется и энергия возбужденного уровня S^*. Однако сдвиг здесь происходит на другую величину (m^*>m⁰) - Е^*. Из-за различия в величинах Е₀ и Е^* происходит смещение частоты максимума поглощения рассматриваемых молекул:

После преобразований получаем, что величина сдвига частоты максимума поглощения (Dn=hn_a-hn₀) при перемещении молекулы из неполярного растворителя в полярный составит:

Поскольку мы постулировали, что m^*>m⁰, в нашем случае Е^* будет больше Е₀. Соответственно, произойдет смещение максимума поглощения вещества в длинноволновую сторону.

При последующем испускании кванта фотолюминесценции излучательный переход происходит с нижнего из возможных колебательных подуровней молекулы люминофора (т.е. в неполярном растворителе квант будет испускаться при переходе S^*® S⁰). Однако в полярном растворителе энергия уровня S^* будет снижена на величину Е^* и составит _рS^*. В синглетно-возбужденном состоянии молекула-люминофор пребывает 10^-8¸10^-9 секунды. Этого времени достаточно, для того, чтобы молекулы растворителя вокруг молекулы-люминофора успели переориентироваться. В результате энергия уровня _рS^* дополнительно падает на величину энергии сольватации DW^*, и становится равной ₁S^*_р. Заметим, что это произойдет только в том случае, если время переориентации молекул растворителя значимо меньше времени жизни синлетно-возбужденных молекул-люминофоров. При низких температурах (менее 170^о К) это условие не выполняется, поэтому излучение кванта фотолюминесценции происходит с более энергонасыщенного уровня.

В обычных же условиях из-за более выраженного изменения энергии уровня S^* в полярном растворителе максимум в спектре фотолюминесценции смещается значительно сильнее, чем в спектре поглощения.

После излучения кванта фотолюминесценции молекула люминофора стабилизируется не сразу. Изначально ранее возбужденный электрон попадает на высший колебательный подуровень S⁰_р,к основного состояния. В ходе этого перехода дипольный момент молекулы снижается, однако переориентация молекул растворителя происходит позже. Соответственно, энергия сольватации в основном состоянии W^о оказывается меньше, чем энергия сольватации W^* в возбужденном. Далее начинается процесс переориентации молекул растворителя, сопровождающийся дальнейшим падением W^о. В результате энергия уровня S⁰_р,к нарастает, т.е. должно произойти дополнительное смещение спектра фотолюминесценции в длинноволновую сторону. В целом, величина смещения частоты максимума фотолюминесценции в полярном растворителе может быть описана следующей формулой:

Измеряя величину смещения полос в спектрах поглощения и фотолюминесценции молекул растворителях различной полярности, можно определить, насколько меняется дипольный момент этих молекул при возбуждении. Квантовая теория ориентационных взаимодействий молекулярных диполей дает следующую формулу:

(79)

В уравнении (79) n_а – частота излучения в максимуме поглощения вещества; n_ф – частота излучения в максимуме его фотолюминесценции; m ^о и m ^* - вектора дипольных моментов молекулы в основном и возбужденном состоянии, h - постоянная Планка; с - скорость света, l – радиус рассматриваемой молекулы-люминофора; E - относительная диэлектрическая проницаемость растворителя; n – его коэффициент преломления.

Расчет изменения дипольного момента вследствие электронного возбуждения по формуле (79) для триптофана дает величину Dm=m ^*- m ^о в 6 Дебай. Иными словами, полоса фотолюминесценции этого соединения смещается при изменении полярности окружения достаточно сильно. Поскольку во многих нативных белках остатки триптофана находятся в гидрофобных, относительно неполярных, частях молекул, вышеуказанное свойство позволяет применять измерение спектров фотолюминесценции триптофана (его остатков в полипептидной цепи изучаемого протеина) для исследования процесса денатурации белков.

Иногда в биологических образцах не удается зарегистрировать собственной фотолюминесценции содержащихся в них молекул-люминофоров. Причин этому может быть несколько, и мы рассмотрим некоторые из них ниже. Здесь же можно отметить, что в таких ситуациях в биологический объект специально вводят извне искусственные люминофорные молекулы, отличающиеся высоким квантовым выходом фотолюминесценции. Если введенный люминофор не присоединяется к какому-либо из компонентов объекта ковалентными связями, его принято обозначать, как флуоресцентный зонд. Если же люминофор ковалентно сшивается с молекулами образца, то это – флуоресцентная метка.

Как и у всех люминофоров, параметры фотолюминесценции у флуоресцентных зондов и меток меняются при изменении их окружения, что позволяет использовать данные соединения для изучения различных характеристик биологических объектов.

В качестве примера приведем значения спектрального положения максимума поглощения и фотолюминесценции для одного из флуоресцентных зондов, диметилхалкона (ДМХ, табл. 2).

Таблица 2. Спектральное положение максимумов поглощения и фотолюминесценции у флуоресцентного зонда диметилхалкона (ДМХ) в растворителях различной полярности.

Публикуется с модификациями по: Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: «Дрофа», 2006, с. 45.

Структурная формула ДМХ:
Тип растворителя	Относительная диэлектрическая проницаемость растворителя E	Положение максимума поглощения, нм	Положение максимума фотолюминесценции, нм
Гептан	1,9
Толуол	2,4
Бутанол	17,7
Метанол	32,7
Вода

Следует заметить, что, поскольку от окружения молекулы-люминофора зависит не только спектральное положение максимума фотолюминесценции, но и квантовый выход этого вторичного свечения, с помощью флуоресцентных зондов можно анализировать достаточно сложные биологические процессы. Например, у так называемых Са²⁺-чувствительных флуоресцентных зондов (quin-2, fura-2, fura-3) квантовый выход фотолюминесценции возрастает на 2-3 порядка после связывания с молекулой зонда иона Са²⁺. Это обстоятельство позволяет с помощью подобных зондов регистрировать, в частности, кинетики изменения концентрации Са²⁺ в цитоплазме клеток в процессе физиологической активации в режиме реального времени.

---

Дата добавления: 2015-07-25