Возможные причины искажений величины регистрируемой фотолюминесценции

Паразитный свет. При регистрации фотолюминесценции предполагается, что ее возбуждение осуществляется либо монохроматическим излучением, либо излучением в достаточно узком спектральном диапазоне. Вместе с тем, как уже указывалось выше, в составе выходящего из любого монохроматора света имеется немонохроматическая примесь - паразитное излучение. Поскольку этот свет – немонохроматический, часть его квантов будет иметь те же длины волн, что и кванты фотолюминесценции. Если эти кванты попадут на фотодетектор флуориметра, результаты измерений интенсивности фотолюминесценции окажутся завышены. Этот эффект особенно силен в светорассеивающих объектах, а также при применении метода регистрации фотолюминесценции по схеме в проходящем свете (рис. 19, А).

Кроме того, паразитное излучение может содержать кванты, которые вызывают фотолюминесценцию кюветы, растворителя и других потенциально способных к фотолюминесценции компонент исследуемого объекта. Если максимумы в спектрах фотолюминесценции у этих компонент объекта близки к таковым у исследуемого вещества, регистрируемая фотолюминесценция может быть дополнительно завышена.

Для учета влияния примеси паразитного излучения следует обязательно измерять величину регистрируемой интенсивности свечения объекта, разместив на пути возбуждающего света (перед кюветой с объектом) светофильтр, который может пропускать кванты фотолюминесценции, но не пропускает кванты возбуждающего излучения в используемом спектральном диапазоне. Регистрируемый сигнал при таком измерении будет состоять из паразитного излучения и фотолюминесценции, связанной с другими веществами, присутствующими в объекте и возбуждаемыми паразитным излучением. Его величину следует затем вычесть из измеренной в обычном режиме интенсивности фотолюминесценции образца.

Комбинационное рассеивание на молекулах воды. Для возбуждения фотолюминесценции большинства соединений в биологических образцах применяется излучение ультрафиолетового спектрального диапазона. Однако это излучение обладает способностью к комбинационному (рамановскому) светорассеиванию на молекулах воды, всегда имеющихся в биологическом объекте. При комбинационном рассеивании явления у части рассеянных квантов изменяется длина волны. В результате в спектре рассеянного света появляются так называемые «синие» и «красные» спутники, т.е. максимумы, смещенные относительно длины волны исходного излучения соответственно в коротко- и длинноволновую сторону (см. выше). К несчастью, у воды имеется такой максимум («красный» спутник), смещенный в длинноволновую сторону примерно на 20¸50 нм, и часто попадающий в область регистрации фотолюминесценции. Если не сделать соответствующей поправки, часть этих рассеянных квантов может быть зарегистрирована, что приведет к завышению результатов измерений фотолюминесценции образца. Для устранения возможного влияния комбинационного рассеивания возбуждающего излучения на молекулах воды при измерении фотолюминесценции следует вычитать из полученных результатов измерения результаты анализа фотолюминесценции кюветы с чистой средой инкубации (растворителем) образца. Следует, впрочем, иметь в виду, что в чистом растворителе величина сигнала комбинационного рассеивания обычно несколько больше, чем в объекте, поскольку в последнем случае часть квантов возбуждающего света поглощается, а не рассеивается.

Экранирование возбуждающего света. Выше, в разделе, посвященном спектрофотометрии, уже указывалось, что в биологических объектах обычно содержится много типов хромофорных молекул, максимумы в спектрах поглощения которых могут накладываться друг на друга. Из-за этого при флуориметрическом анализе трудно бывает подобрать такую длину волны возбуждающего света, при которой поглощал бы свет и возбуждался только один люминофор. Обычно поглощает возбуждающее излучение не только исследуемое вещество, но и другие хромофоры объекта. Как следствие, доля возбуждающего света, попадающего на молекулы исследуемого соединения, т.е реальная величина J₀ для него, оказывается занижена. Соответственно, снижается (в сравнении с раствором чистого люминофора данного типа) и величина J_фл. Это явление носит название экранирование возбуждающего света или эффект экранировки. При использовании затем для определения концентрации исследуемого вещества калибровочной зависимости J_фл=f(c), полученной по образцам с растворами чистого люминофора, результат оказывается занижен.

Для расчёта поправочного коэффициента на эффект экранировки рассмотрим следующую модель: пусть имеется плоскопараллельный объект толщиной l на который строго нормально к поверхности падает параллельный пучок монохроматического излучения с интенсивностью J₀. На расстоянии х от передней стенки объекта выберем слой толщиной dx, достаточно тонкий для того, чтобы эффектом экранировки в нем можно было пренебречь. В соответствии с законом Бугера-Ламберта-Бера интенсивность света J^¢, попадающая на слой dx, будет составлять:

(58)

В выражении (58) e - величина молярного коэффициента поглощения на длине волны возбуждения у исследуемого вещества; с – концентрация этого вещества в образце; e_i и с_i – соответственно молярный коэффициент поглощения и концентрация i -го экранирующего соединения.

Запишем теперь, насколько ослабиться J^¢ после прохождения слоя dx. Поскольку толщина этого слоя мала, это ослабление (dJ^¢) составит:

(59)

Общее же ослабление возбуждающего света за счет поглощения исследуемым веществом (DJ¢) составит:

(60)

В полученном выражении (60) D_об и D – соответственно, общая оптическая плотность образца и оптическая плотность исследуемого вещества на длине волны возбуждающего света.

С учетом того, что интенсивность фотолюминесценции J_фл в любом случае есть

мы можем написать, что поправочный коэффициент d_э на величину экранирующего эффекта будет равен:

(61)

В выражении (61) J_фл – интенсивность фотолюминесценции исследуемого люминофора в отсутствие экранирования возбуждающего света; J^¢_фл - эта интенсивность в условиях экранирования; D_об и D – соответственно, общая оптическая плотность образца и оптическая плотность исследуемого вещества на длине волны возбуждающего света. Измерив J^¢_фл можно, таким образом, рассчитать J_фл, умножив J^¢_фл на d_э.

Из выражения (61) вытекает, что в разбавленных объектах (при D_об<0,1) влияние экранирования возбуждающего света на регистрируемую J_фл будет невелико (в этом случае d_э® 1). Это позволяет использовать разведение образца как один из способов снижения влияния эффекта экранировки на регистрируемую фотолюминесценцию конкретного соединения.

Дата добавления: 2015-07-25