Методы регистрации фотолюминесценции. Спектрофлуориметры. Особенности флуориметрии биологических объектов.

Хотя фотолюминесценция бывает двух типов (флуоресценция и фосфоресценция), приборы, применяемые для ее регистрации, называются флуориметрами. Если же прибор позволяет регистрировать еще и спектральные характеристики фотолюминесценции, то это спектрофлуориметр.

Отсутствие упоминания о регистрации фосфоресценции в названиях приборов связано, скорее всего, с тем, что в жидких объектах (растворах) этот вид вторичного свечения при комнатной температуре практически не наблюдается – из-за большого времени пребывания электронов на орбитали Т вероятность излучательного перехода Т®S₀ оказывается мала (см. выше). Для регистрации фосфоресценции требуется, чтобы подвижность люминесцирующих молекул в объекте была ограничена. Этого можно достичь либо путем охлаждения образца до низких температур (например, до 77^оК), либо путем применения растворителей с очень высокой вязкостью. Имеется, впрочем, ряд специфических биологических объектов, в которых фосфоресценцию можно регистрировать и при комнатной температуре. К таковым, например, относится ткань хрусталика глаза.

Простейшие флуориметры не содержат в своей оптической схеме монохроматоров. Выделение нужных спектральных участков излучения в таких приборах осуществляется с помощью сменных светофильтров (рис. 17.)

Рисунок 17. Схема регистрации фотолюминесценции на флуориметре со сменными светофильтрами. К- кювета с образцом; 1 –светофильтр для выделения возбуждающего света (J₀) и его спектр пропускания; 2 – светофильтр для выделения фотолюминесценции (J_фл) и его спектр пропускания; (1+2) – суммарный спектр пропускания светофильтров 1 и 2.

Публикуется с модификациями по: Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: «Дрофа», 2006, с. 42.

Такой вариант флуориметров отличается достаточно высокой чувствительностью, простотой и дешивизной. Однако эти приборы не позволяют регистрировать спектральные характеристики вторичного свечения и, следовательно, их нельзя использовать при решении качественных задач.

Применение флуориметров со сменными светофильтрами требует правильного подбора тех светофильтров, которые будут применяться в каждом конкретном случае. Светофильтр для выделения возбуждающего света должен пропускать только то излучение, которое поглощается исследуемым люминофором, но не должен пропускать излучение источника в области, где данный люминофор люминесцирует. Светофильтр же для выделения фотолюминесценции должен пропускать только кванты этой люминесценции, но обязан полностью задерживать весь возбуждающий свет. Сложенные вместе, эти два светофильтра, как правило, света в зоне проведения измерений вообще не пропускают (рис. 17).

Спектрофлуориметры (рис. 18) содержат в своей схеме 2 монохроматора (один располагается между источником излучения и объектом, второй – между объектом и фотодетектором). Эти приборы позволяют полностью использовать преимущества люминесцентного анализа, поскольку на них можно регистрировать как спектры фотолюминесценции, так и спектры возбуждения фотолюминесценции.

Определение 17:

Спектром возбуждения фотолюминесценции называется зависимость интенсивности фотолюминесценции от длины волны (энергии квантов, частоты, волнового числа) возбуждающего излучения при постоянной интенсивности последнего.

Рисунок 18. Схема спектрофлуориметра. 1 – источник излучения; 2 –конденсорная линза; 3 и 5 – монохроматоры; 4 – кювета с образцом; 6 - фотодетектор (фотоэлектронный умножитель); 7 – блок питания фотодетектора; 8 - усилитель сигнала фотодетектора (усилитель постоянного тока с высоким входным сопротивлением); 9 – регистрирующее устройство (самописец или аналогово-цифровой преобразователь; в последнем случае сигнал фотодетектора регистрируется затем компьютером в цифровой форме). J₀ – возбуждающее излучение; J_л – люминесценция.

Публикуется с модификациями по: Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: «Дрофа», 2006, с. 43.

Существует 3 схемы регистрации люминесценции образцов, различающиеся по углу между направлением освещения объекта (направлением падения возбуждающего света) и направлением регистрации люминесценции (рис. 19).

		В.

Рисунок 19. Схемы регистрации фотолюминесценции. J₀ – возбуждающее излучение; J_фл - фотолюминесценция. А – регистрация в проходящем свете; Б – регистрация под прямым углом; В – регистрация с передней стенки кюветы.

Следует заметить, что эти 3 схемы различаются по чувствительности к артефактам, мешающим проведению флуориметрических измерений. В частности, схема регистрации в проходящем свете (рис. 19, А) требует особой предосторожности: при ее использовании высока вероятность попадания на фотодетектор блуждающего света, содержащегося в попадающем на объект излучении. Кроме того, при такой схеме регистрации регистрируемая люминесценция особенно сильно меняется вследствие таких эффектов, как экранировка возбуждающего света, реабсорбция фотолюминесценции, светорассеивание (см. ниже). Видимо, поэтому данная схема в спектрофлуориметрах встречается весьма редко. В большинстве приборов этого типа, имеющихся в продаже, применена схема регистрации фотолюминесценции под прямым углом (рис. 19, Б). Эта схема позволяет ослабить влияние на результаты измерений собственной люминесценции кюветы и удобна при небольшой оптической плотности объекта. Однако и в этом случае регистрируемая люминесценция оказывается чувствительна к наличию в объекте светорассеивания и другим артефактам. Кроме того, с ростом концентрации люминесцирующих молекул из-за того, что при больших D они начинают возбуждаться только в тонком слое вблизи передней стенки кюветы, регистрируемый поток J_фл при измерении с использованием данной схемы начинает резко снижаться (на зависимости J_фл=f(c) наблюдается «загиб» вниз). Поскольку биологические образцы обычно отличаются достаточно высокой концентрацией вещества и часто сильно рассеивают свет, при их флуориметрическом исследовании удобнее всего применять схему регистрации люминесценции с передней стенки кюветы (рис. 19, В). При такой схеме регистрации, если концентрация люминофоров достаточно высока, кванты возбуждающего света глубоко в объект не проникают. Соответственно, регистрируется люминесценция тонкого слоя образца, прилегающего к его передней поверхности. Из-за небольшого расстояния, которое при данной схеме измерения кванты возбуждающего света и кванты фотолюминесценции проходят в веществе объекта, влияние большинства артефактов, изменяющих регистрируемое свечение, оказывается достаточно мало.

Рассмотрим теперь те артефакты, которые мешают измерению фотолюминесценции.

Дата добавления: 2015-07-25