Методи дезинтеграции зараженных вирусом клеток.

Для характеристики вирусов в первую очередь важны их биохимические и биофизические свойства. Чтобы исследовать эти свойства, вирусы необходимо очистить.

Поскольку все известные вирусы - облигатные внутриклеточные паразиты, культивирование их производится либо в организмах интактных хозяев, либо а культуре клеток. Поэтому первой стадией получения вирусного препарата большинстве случаев является разрушение инфицированных клеток с целью высвобождения накопленного вируса.

Чтобы обеспечить полное освобождение вируса, эту операцию рекомендуется проводить даже в тех случаях, когда вирусная инфекция заканчивается лизисом большинства клеток. Разрушение клеток производят механическим способом (гомогенизацией, ультразвуковой дезинтеграцией, растиранием с кварцевым песком, продавливанием инфицированных клеток через пресс и т. д.). Эффективность разрушения растительных клеток можно повысить путем их предварительного замораживания, хотя в некоторых случаях это приводит к снижению выхода вируса.

Выбор экстрагирующего буферного раствора может оказать решающее влияние на эффективность очистки вируса. Для экстракции многих изометрических вирусов удобны кислые буферные растворы с рН около 5. дополнительное преимущество подобных растворов — осаждение многих клеточных белков при кислой реакции среды. Однако некоторые изометрические вирусы, например вирус мозаики огурцов и вирус кольцевой пятнистости табака, при рН около 5 выпадают в осадок, и поэтому для их выделения следует использовать растворы с рН, близким к нейтральному.

Наиболее распространенные дополнительные компоненты используемых растворов — это восстановители, препятствующие действию полифенолоксидаз растительных тканей (аскорбиновую кислоту, аскорбат натрия, сульфит натрия. Для подавления активности ферментов и диссоциации рибосом используют также хелатирующие агенты, чаще всего натриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).

В результате разрушения зараженных клеток получают суспензию, содержащую клеточные компоненты и вирусные частицы, причем вирус, как правило, в суспензии оказывается сильно разбавленным. Таким образом, задача получения вирусного препарата сводится к очистке вируссодержащей суспензии от клеточных компонентов и к концентрированию Обычно эти две задачи решаются параллельно в несколько приемов с применением ряда методов.

6.Низкоскоростное центрифугирование как первуй этап очистки вірусів. Екстракція фітовірусів органічними розчинниками.

Первым этапом очистки вирусов является низкоскоростное центрифугирование (3-5 тыс. об./мин, 10-20 мин). Крупные частицы (неразрушенные клетки, ядра, фрагменты оболочки) при этом отделяются с осадком, а содержащая вирус надосадочная жидкость подвергается дальнейшей очистке. На этом этапе концентрирование вирусов не происходит, т.к. часть вируса адсорбируется на удаляемых частицах, поэтому осадок рекомендуется промывать и повторно центрифугировать. Для уменьшения процесса адсорбции низкоскоростное центрифугирование стараются проводить сразу после разрушения клеток.

При выделении вирусов растений производят экстракцию органическими растворителями, такими как хлороформ или смесь хлороформа с бутанолом (1:1), фреон и т.д. Суспензию вируса встряхивают с органическим растворителем 5-15 мин, прогревают при температуре 50-60⁰С, и денатурированные клеточные белки отделяют низкоскоростным ценрифугированием 10-15 тыс.об./мин, 15-20 мин.

На следующих стадиях очистки применяются разнообразные методы. Поскольку вирусные частицы имеют белковую (или липопротеиновую) оболочку, для их очистки и концентрирования можно использовать общие методы белковой химии, такие как осаждение в изоэлектрической точке и осаждение сульфатом аммония.

7.Осаждение вирусов в изоэлектрической точке.

Осаждение в изоэлектрической точке (ИЭТ). Поскольку в состав наружной оболочки вирусов, как правило, входят слабокислые белки, ИЭТ большинства вирусов лежит в области рН 3,5-6,0. Метод осаждения в изоэлектрической точки можно применять в простом варианте, доводя рН суспензии до нужной величины и отделяя преципитат вируса низкоскоростным центрифугированием. При этом вместе с вирусом будут осаждаться балластные белки, имеющие более высокую ИЭТ, чем вирус. Этот метод позволяет сконцентрировать вирус, т.к. последующее ресуспендирование осуществляется в значительно меньшем объеме. Осаждение в ИЭТ можно применять и в «дробном» варианте. Допустим ИЭТ вируса лежит в области рН 4,0. В этом случае рН суспензии сначала доводят до 5,0 и низкоскоростным центрифугированием удаляют осаждающиеся примеси. Затем подкисляют суспензию до рН 4,0. Вирус при этом агрегирует и осаждается. Недостаток метода: многие вирусы чувствительны даже к незначительным изменениям рН среды, и такая обработка может привести к потери биологической активности или даже к разрушению вирионов.

8. Висалювання сірчанокислим амонієм. Діаліз.

Осаждение сульфатом аммония. Процедура очистки и концентрирования вирусов этим методом принципиально не отличается от аналогичного метода фракционирования белков. Требуемая для осаждения вируса концентрация сульфата аммония может быть выражена двумя способами: объемно-весовыми процентами соли (например, 25 % - 25 г соли в 100 мл раствора) либо процентом от насыщения (например, 25 % насыщения сульфатом аммония – 11 г соли в 100 мл суспензии; насыщенный раствор сульфата аммония содержит 430 г соли в 1 л раствора). Метод весьма эффективен, как и предыдущий метод осаждения в ИЭТ, но имеет ряд недостатков, т. к. некоторые вирусы разрушаются в растворах с высокой ионной силой. При осаждении вируса из очень большого объема (литры и даже десятки литров) требуется большое количества соли (килограммы). После осаждения вируса сульфатом аммония проводят низкоскоростное центрифугирование (6 тыс. об/мин, 20 мин), надосадочную жидкость сливают, а вирусный осадок суспендируют в небольшом количестве буферного раствора, содержащего ЭДТА. Следующая стадия очистки – диализ, при котором происходит удаление ионов соли и частичное освобождение от балластных веществ. Для этого диализный мешочек, помещенный в сосуд с водой (3-5 л), наливают суспензию вируса. Сосуд устанавливают на магнитную мешалку, диализ ведут в течение суток с трехкратной сменой диализирующей жидкости. Суспензию центрифугируем при 15-18 тыс. об/мин для удаления нерастворившегося осадка.

9. Концентрирование фитовирусов за допомогою поліетиленгліколя. Дифференціальне центрифугування.

Концентрирование фитовирусов обычно осуществляют с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) или путем высокоскоростного центрифугирования (метод дифференциального центрифугирования). Типичные условия осаждения ПЭГ следующие: для палочковидных вирусов используют 2,5% (вес на объем) ПЭГ и 0,1 М NaCl, а для изометрических вирусов— 10% (вес на объем) ПЭГ в присутствии 0,1 М NaCl; для эффективного осаждения необходимо поддерживать достаточно высокую концентрацию соли. Обычно ПЭГ и соль добавляют к раствору, содержащему вирус, растворяют их в течение часа при постоянном перемешивании и затем собирают осадок вируса высокоскоростным центрифугированием. Для разных вирусов (в зависимости от их размера, физической и химической структуры, молекулярной массы) диапазон центрифугирования, обеспечивающий выпадения вируса в осадок, варьирует от 25 000 до 200 000 g, время ценрифугирования колеблется от нескольких десятков минут до 4-6 ч. Высокоскоростное центрифугирование большинства типичных изометрических вирусов (80—130 S) проводят при 70000 g в течение 3 ч, а большинства палочковидных вирусов (130—180 S)—при 50000 g в течение 2ч. Осадок вируса ресуспендируют в небольшом растворе буфера (растворение при 0 - +4 ^оС, 4-8 ч на магнитной мешалке) и центрифугируют при умеренном режиме 15-18 тыс. об/мин, осадок промывают, вновь центрифугируют. Растворы, полученные в результате отделения надосадочной жидкости объеденяют и сохраняют. Для повышения степени очистки проводят 3-4 цикла дифференциального центрифугирования.

Для достижения более высоких степеней очистки применяются дополнительные методы, основанные на поверхностных химических свойствах вирусов.

10. Зональное (скоростоное) ценрифугування в градієнті щільності.

Зональное (скоростное) центрифугирование в градиенте плотности является одним из самых совершенных методов препаративной техники вирусологических исследований. Принцип метода состоит в том, что компоненты смеси, различающиеся по скорости седиментации, перемещаются под действием центробежной силы в центрифужной пробирке через непрерывный градиент концентрации. С целью приготовления градиентов концентрации чаще всего применяют сахарозу. Градиент концентрации сахарозы препятствует конвекции и стабилизирует зоны частиц.

В условиях градиента концентрации сахарозы определенную роль может играть плавучая плотность молекул. Это означает, что частицы с плавучей плотностью, близкой или равной плотности растворителя, будут двигаться медленнее или не будут седиментировать вообще, в отличие от частиц с такой же молекулярной массы и формы, но с большей плотностью.

При фракционировании этим методом смесей белков, нуклеиновых кислот и многих вирусов разделение основано главным образом на различиях в величине скорости седиментации молекул, а не на величине плавучей плотности. Это обусловлено тем, что плотность молекул нуклеиновых кислот, а также большинства вирусов значительно выше плотности самых концентрированных растворов сахарозы, поэтому при длительном центрифугировании все они не достигнут положения равновесия, а осядут на дно центрифужной пробирки. С другой стороны, при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы можно фракционировать по плотности смеси, содержащие частицы с меньшей величиной плавучей плотности (вирусы с в состав которых входят липиды).

При очистке большинства простых (т. е. состоящих только из белковой оболочки и нуклеиновой кислоты) вирусов применяют 10—40%-ные сахарозные градиенты.

Раствор, содержащий вирус, осторожно наслаивают на поверхность градиента. Центрифугирование проводят в роторах со свободно подвешенными стаканами в режиме 25 -65 тыс об./мин, 1,5-2 ч при 4^оС.

Зоны вируса можно увидеть при освещении сверху (они интенсивно рассеивают свет) и отобрать через верх пробирки шприцем с иглой, изогнутой под прямым углом недалеко от конца, прокалывая пробирку сбоку или фракционированием через дно пробирки. Возможно использование и более сложных приспособлений, например прибора для фракционирования градиентов фирмы Isco, в котором раствор вытесняется снизу вверх и проходит через спектрофотометрическую кювету для регистрации оптической плотности. Сахарозу можно удалить диализом против подходящего буферного раствора или осаждением вируса ПЭГ.

11. Изопикическое центрифугування. Визначення плавучой щільності віріонів.

Изопикническое центрифугирование для очистки вирусов проводят обычно в растворах хлористого или сернокислого цезия. Центрифугирование раствора в течение длительного времени приводит к установлению равновесия, при котором концентрация растворенного вещества возрастает в направлении от оси вращения и создает, таким образом (в сочетании с увеличивающимся давлением), градиент плотности. Равновесие обуславливается тем, что в каждой точке сумма центробежных, центростремительных сил и сил, вызывающих тепловое движение молекул (диффузия), становится равной нулю. Давление, возникающее в центрифужной пробирке, не приводит к перераспределению соли. Если в градиенте плотности центрифугировать макромолекулы, концентрация которых значительно ниже концентрации соли, используемой для создания градиента, то каждая молекула займет в градиенте положение, соответствующее ее плавучей плотности. Этот параметр макромолекулы определяется как плотность раствора, с которым молекула находится в равновесии.

Изопикнические градиенты получают центрифугированием в роторе SW40 при 36 000 об/мин или SW50 при 40 000 об/мин в течение 12 - 96 ч. Лучший результат достигается при центрифугировании в угловых роторах, а не в бакет-роторах.

Зоны вируса обнаруживают при освещении пробирки сверху и извлекают шприцем, проколов пробирку сбоку. Соли цезия затем удаляют диализом.

Для определения плавучей плотности частиц дно центрифужной пробирки прокалывают с помощью специального приспособления, и поток жидкости, движимый насосом, протекает через микрокювету спектрофотометра, одновременно устройство, соединенное со спектрофотометром, вычерчивает кривую поглощения УФ-лучей различными зонами градиента. Вытекающий из проточной кюветы спектрофотометра раствор можно собрать по объему на фракции. Присутствие вируса во фракции обнаруживают по инфекционности. Измерив коэффициент преломления в нескольких фракциях, рассчитывают плотность солевого раствора в каждой фракции по специальной формуле

ρ²⁵=а n²⁵– b,

где коэффициенты преломления при 25^оС, а и б коэффициенты, различные для хлористого цезия и сульфата цезия.

Далее строят график зависимости плотности солевого раствора от глубины центрифужной пробирки или номера фракции. Паралельно располагают график зависимости активности вируса. Плавучая плотность вирусной смеси определяется как плотность солевого раствора в содержащей этот компонент фракции.

12. Оптические системы регістрації межі сидементації

В настоящее время применяются в основном три оптические системы регистрации границ седиментации: ультрафиолетовая абсорбционная система, шлирен-система Филпота-Свенссона и интерференционная система.

Ультрафиолетовая абсорбционная система содержит монохроматор, позволяющий выбрать длину волны, оптимальную для анализа соответствующих объектов. Система позволяет исследовать вещества приочень низких концентрациях (белки – 2 мкг/мл, ДНК или РНК – 10 мкг/мл). Для измерения оптической плотности при ультрацентрифугировании обычно используют двухлучевую систему фотоэлектического сканирования, работающую по принципу раздвоенного луча и позволяющую сравнивать раствор исследуемого вещества и чистый растворитель, находящийся в разных секторах двухсекторной ячейки. Сканирование производится по всей длине ячейки через определенные промежутки времени. Результаты сканирования представляются в виде сидиментограммы, получаемой с применением самописца.

Шлирен-система позволяет регистрировать градиент коэффициента преломления n (dn/dx) по высоте ячейки с исследуемым раствором., при использовании специальной оптической системы. Величина dn/dx достигает максимума в точке наибольшего изменения концентрации раствора в ячейке. Эта точка принимается за границу седиментации. Расстояние от границы седиментации до оси вращения находят по уравнению (1), где ∆х – расстояние от вершины пика до полосы второго индексного отверстия на седиментограмме.

Интерференционная система позволяет провести измерения коэффициента преломления n наразных уровнях ячейки, т. е. получить изображение зависимости n от расстояния от оси вращения.

Дата добавления: 2015-10-13