Использование модельных систем

При проведении биофизических исследований используют модельные системы.

Ситема меньших размеров.

Структурное разрешение любого метода ухудшается с ростом размеров молекулы. Гораздо легче исследовать небольшую часть системы с очень большим разрешением, а потом использовать эти результаты для того, чтобы судить о ее структуре в целой системе. Так спектроскопические методы успешно используются для исследования структуры достаточно малых молекул, у которых спектральный вклад каждой группы может быть определен и измерен по отдельности. Поскольку спектры молекул большего размера получают путем усреднения по многим звеньям, детальная их интерпретация затруднительна. Если же свойства отдельных звеньев в заданном окружении и в заданной конформации известна из модельных исследований, то иногда удается установить установить соответствие спектра полимерной системы определенным гипотезам относительно ее структуры.

Наблюдение за частью системы.

Работа с частью системы, физически отделенной от системы в целом, таит в себе опасность получение неверных результатов, поскольку эта часть необязательно может вести себя также, как в интктной системе. Поэтому разрабатывают такие подходы, позволяющие наблюдать за этой частью системы, но в составе интактной системы. Для этого используются зонды или метки. Иногда макромолекула сама содержит такой зонд, например ион переходного металла в функциональном центре. Исследователь может ввести зонд в заданную структуру путем его ковалентного присоединения или нековалентного связывания. Важно, чтобы введение зонда не привело к нарушению структуры системы. В практике современной вирусологии часто используют введение изотопной метки в сочетании с электрофорезом и хроматографией при исследовании таких процесов, как сборка вириона, транспорт и локализация вируса в клетке.

Сравнение между собой почти идентичных систем.

В биофизических исследованиях при изучении функции системы используют мутантные белки или нуклеиновые кислоты. При этом подходе в одной или нескольких аминокислот или нуклеотидах макромолекулы производят замены, которые приводят к изменению ее функции. В вирусологических исследованиях при изучении внутриклеточных событий в ходе вирусной инфекции часто используют условно-летальные мутанты. Наибольшую информацию можно получить, используя мутантов, которые размножаются в клетках данного хозяина только в определенном диапазоне температур (температурочувстительные мутанты: чувствительные к теплу, холоду). Такая чувствительность объясняется тем, что в результате мутации определенный белок вследствие аминокислотных замен сохраняет свою активность лишь при определенных (пермиссивных) температурах. Такие мутации сказываются на процессах синтеза нуклеиновых кислот, ранних и поздних белков, а также на ходе вирусного морфогенеза. В пермиссивных условиях мутантный вирус способен к размножению. Остановка размножения на определенном этапе при непермиссивных условиях обычно указывает на ту стадию процесса, для которой требуется продукт мутантного гена. Это позволяет выяснить, какие именно гены ответственны за тот или иной этап процесса.

4. Использование физико-химических методов для вивчення вірусів на молекулярному і субмолекулярному рівнях.

Для характеристики вирусных частиц широко применяют физические и физико-химические методы. Пользуясь ими, можно определить размер, форму, коэффициент седиментации, коэффициент диффузии, плотность и молекулярный вес как самой вирусной частицы, так и ее компонентов.

Для определения размеров вирусных частиц используют: фильтрование вируссодержащего материала через мембраны, ультрацентрифугирование, электрофорез, электронную микроскопию.
Фильтрование через коллодиевые мембраны. Метод основан на пропускании вируссодержащего материала через мембраны с известным размером пор. Размер вирусной частицы в данном случае определяется весьма приблизительно.
Осаждение при ультрацентрифугировании. Многие способы определения размеров вирионов основаны на анализе скорости их движения в суспендирующей жидкости. Частицы, взвешенные в жидкости, оседают с разной скоростью, благодаря чему компоненты взвеси можно быстро разделить центрифугированием. Скорость осаждения частицы прямо пропорциональна разности плотности частиц и жидкости, квадрату угловой скорости и квадрату радиуса окружности и обратно пропорциональна вязкости жидкости.

Електрофорез. Электрофоретические методы позволяют определить специфическую физическую характеристику вирусной частицы - относительную электрофоретическую подвижность под влиянием электрического поля. В противоположность коэффициентам седиментации и диффузии эта величина практически не зависит от массы частицы и основывается главным образом на суммарном заряде поверхности частицы.

Классический метод электрофореза, или метод движущейся границы Тизелиуса, широко используемый для анализа белков применяется для физико-химической характеристики вирусных частиц - определения изоэлектрической точки и электрофоретической подвижности.
Фронтальный электрофорез - единственный метод, позволяющий определить электрофоретическую подвижность и изоэлектрическую точку с очень высокой точностью. Кроме того, этот метод широко используется при исследовании гомогенности и степени чистоты вирусных препаратов.
Еще более разрешающий метод - метод зонального электрофореза в градиенте плотности и в гелях. Его используют не только для изучения специфической электрофоретической подвижности вирусов, их дифференцировки и идентификации, но и для выделения генетически однородных штаммов и изучении изменчивости микроорганизмов.

Детали структуры вируса можно различить только в электронном микроскопе. Широко используется метод негативного контрастирования. Он сводится к смешиванию суспензий вирусных частиц с раствором соли тяжелого металла, нанесению тонкого слоя полученной суспензии на сетку из вольфрамовой пленки и высушиванию полученного препарата. Соль образует плотный слой, на фоне которого материал выглядит сравнительно прозрачным. Обычно соль проникает в различные компоненты вирусной частицы неодинаково, благодаря чему возникает достаточный контраст, способствующий выявлению тончайших деталей структуры вирусной частицы.

Дата добавления: 2015-10-13