Ход работы. 1) Нитроцеллюлозную мембрану инкубируют в блокирующем буфере в течение 30 минут при

1) Нитроцеллюлозную мембрану инкубируют в блокирующем буфере в течение 30 минут при +37°С, при перемешивании (в термостате на качалке).

2) Дважды ополаскивают буфером для промывки.

3) Исходная концентрация первых антител:

· антитела к Лф: 0,27 мг/мл

· антитела к МПО: 0,11 мг/мл

Для инкубации мембран необходимо по 15 мл раствора на чашку, следовательно, для 4 чашек нужно по 30 мл разведенных в буфере антител. При приготовлении раствора антител к Лф к 30 мл буфера для разведения проб было добавлено 120 мкл антител к Лф.

При приготовлении раствора антител к МПО к 30 мл буфера для разведения проб было добавлено 280 мкл антител к МПО. Таким образом конечная концентрация антител в пробах составила

· антитела к Лф: 1,08 мг/мл

· антитела к МПО: 1,02 мг/мл

Мембраны инкубируют в растворе первых антител в течение 60 минут при +37°С в термостате на качалке.

4) Тщательно отмывают от не связавшегося антигена буфером для промывки 3 раза по 5 минут на качалке при комнатной температуре.

5) Для инкубации дотов с вторичными антителами в 30 мл буфера для разведения проб добавляют 30 мкл антивидовых антител козы к антителам кролика, конъюгированных с пероксидазой хрена.

Для инкубации блотов в 30 мл буфера для разведения проб добавляют 30 мкл вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена и разведенных в 100 раз (30 мкл), и 15 мкл StrepTactin, конъюгированного с пероксидазой хрена.

Мембраны инкубируют в течение 60 минут при +37°С, при перемешивании (в термостате на качалке).

6) Тщательно отмывают от несвязавшегося конъюгата буфером для промывки 3 раза по 5 минут на качалке при комнатной температуре.

7) Мембраны уравновешивают раствором для пероксидазной реакции в течение 5 мин при комнатной температуре, желательно при перемешивании.

8) Мембраны инкубируют в растворе субстрата, не допуская прямого попадания яркого света, и наблюдают за развитием окраски.

Реакцию останавливают промыванием мембраны дистиллированной водой и высушивают на воздухе.

Результаты:

Таблица1. Концентрация МПО в образцах при дот-иммуноферментном анализе.

Образец	Концентрация МПО в образце, мг/мл
Слюна	0,016
Экстракт 1	1,7
Экстракт 2	1,74 (0,69)
Экстракт 3	0,9
Молоко человека	2,25 (4,4)
Слезы	6,1

Таблица 2. Концентрация ЛФ в образцах при дот-иммуноферментном анализе.

Образец	Концентрация ЛФ в образце, мг/мл
Слюна	0,2
Экстракт 1	0,7
Экстракт 2	0,4
Экстракт 3	0,4
Молоко человека	0,4
Слезы	0,7

Рисунок 1. Дот-ИФА

Дата добавления: 2015-07-20