Аффинная хроматография

1) Колонки уравновесили фосфатным буфером – 5 объемами каждую.

2) Нанесли фракции сывороточных белков, обогащенные иммуноглобулинами. Эти фракции были получены диализом против 0,01 М натрий-фосфатного буфера, рН 7,4, содержащего 0,15 М NaCl; т. е.:

А) раствор АТ к ЛФ – 10 мл (в мембрану заливали 6 мл),

В) раствор АТ к МПО – 14 мл (в мембрану заливали 8 мл).

Элюаты с колонок собрали в пробирки «проскок», оставили при + 4º.

3) Колонки промыли фосфатным буфером до нулевых значений оптической плотности при длине волны 280 нм (на каждую колонку – 95 мл PBS).

4) Элюцию антител осуществляли раствором глицина-HCl (рН 3,0) со скоростью около 20 мл/ч (скорость элюции с колонки с иммобилизованным лактоферрином была меньше, чем с иммобилизованной миелопероксидзой; после перезабивания колонки с МПО скорость элюции с этой колонки стала меньше, чем с колонки с ЛФ). Для этого нанесли на колонку 1 колоночный объем (3 мл) глицинового буфера, собрали элюат в пробирки с №1, закрыли колонку и оставили на 15 минут для наилучшего последующего схождения АТ. Далее собрали элюаты еще в 23 пробирки для каждого раствора АТ.

5) Концентрацию антител определили по поглощению при длине волны 280 нм – 1 мг/мл дает значение оптической плотности 1,34.

6) Колонки промыли PBS (90 мл на каждую колонку).

После определения профиля элюции решено было повторить пункты 2-6 для колонки с пришитым ЛФ – 1 раз, а для колонки с пришитой МПО- 3 раза, при этом нанесение «проскока» в одном прогоне происходило дважды.

Полученные результаты представлены в таблицах и на графиках.

Таблица №1. АТ к МПО. Первый элюат.

№ пробирки	Объем элюции, мл	А 280	мг/мл	мг в 3 мл
		0,09	0,067	0,201
		0,28	0,209	0,627
		0,11	0,082	0,246
		0,055	0,041	0,123
		0,04	0,030	0,090
		0,03	0,022	0,067
		0,026	0,019	0,058
		0,022	0,016	0,049
		0,02	0,015	0,045
		0,02	0,015	0,045
		0,025	0,019	0,056
		0,03	0,022	0,067
		0,025	0,019	0,056
		0,025	0,019	0,056
		0,02	0,015	0,045
		0,02	0,015	0,045
		0,02	0,015	0,045
		0,025	0,019	0,056
		0,015	0,011	0,034
		0,02	0,015	0,045
		0,035	0,026	0,078
		0,02	0,015	0,045
		0,02	0,015	0,045
		0,015	0,011	0,034

Таблица №2. АТ к МПО. Второй элюат.

№ пробирки	Объем элюции, мл	А 280	мг/мл	мг в 3 мл
1'		0,4	0,299	0,896
2’		0,15	0,112	0,336
3’		0,06	0,045	0,134
4’		0,045	0,034	0,101
5’		0,04	0,030	0,090
6’		0,025	0,019	0,056

Таблица №3. АТ к МПО. Третий элюат.

№ пробирки	Объем элюции, мл	А 280	мг/мл	мг в 3 мл
1’’		0,155	0,116	0,347
2’’		0,3	0,224	0,672
3’’		0,109	0,081	0,244
4’’		0,065	0,049	0,146
5’’		0,045	0,034	0,101
6’’		0,035	0,026	0,078
7’’		0,03	0,022	0,067
8’’		0,021	0,016	0,047
9’’		0,019	0,014	0,043
10’’		0,015	0,011	0,034

Таблица №4. АТ к МПО. Четвертый элюат.

№ пробирки	Объем элюции, мл	А 280	мг/мл	мг в 3 мл
1’’’		0,165	0,123	0,369
2’’’		0,193	0,144	0,432
3’’’		0,06	0,045	0,134
4’’’		0,036	0,027	0,081
1’’’		0,165	0,123	0,369
2’’’		0,193	0,144	0,432

Таблица №5. АТ к ЛФ. Первый элюат.

№ пробирки	Объем элюции, мл	А 280	мг/мл	мг в 3 мл
		0,26	0,194	0,582
		1,7	1,269	3,806
		0,7	0,522	1,567
		0,33	0,246	0,739
		0,218	0,163	0,488
		0,168	0,125	0,376
		0,118	0,088	0,264
		0,1	0,075	0,224
		0,09	0,067	0,201
		0,065	0,049	0,146
		0,065	0,049	0,146
		0,059	0,044	0,132
		0,055	0,041	0,123
		0,051	0,038	0,114
		0,0505	0,038	0,113
		0,048	0,036	0,107
		0,046	0,034	0,103
		0,042	0,031	0,094
		0,039	0,029	0,087
		0,031	0,023	0,069
		0,029	0,022	0,065
		0,027	0,020	0,060
		0,025	0,019	0,056
		0,02	0,015	0,045

Таблица №6. АТ к ЛФ. Второй элюат.

№ пробирки	Объем элюции, мл	А 280	мг/мл	мг в 3,5 мл
1’		0,079	0,059	0,206
2’		0,23	0,172	0,601
3’		0,098	0,073	0,256
4’		0,055	0,041	0,144
5’		0,04	0,030	0,104
6’		0,029	0,022	0,076
7’		0,025	0,019	0,065
8’		0,021	0,016	0,055
9’		0,02	0,015	0,052
10’		0,021	0,016	0,055
11’		0,025	0,019	0,065

Исходя из полученных результатов, для конъюгации полученных из сыворотки крови первых АТ с пероксидазой хрена (ПХ) было объединено содержимое следующих пробирок и подвергнуто диализу в течение ночи при +4°С против 0,05 М натрий-карбонатного буфера, рН 9,5:

1) АТ к ЛФ – 1 и 3 (т.е. 2,1 мг на 6 мл);

2) АТ к МПО -1, 2 и 1' (т.е. 1,7 мг на 9 мл).

Концентрацию АТ к МПО и ЛФ в объединенных элюатах до и после диализа определили по поглощению при длине волны 280 нм – 1 мг/мл дает значение оптической плотности 1,34. Результаты представлены в таблице №7.

Таблица №7.Содержание АТ к ЛФ и МПО до и после диализа против натрий-карбонатного буфера перед конъюгацией.

Типы АТ	А 280 до диализа	объем до диализа, мл	содержание АТ до диализа, мг	А 280 после диализа	конечный объем после диализа	конечное содержание АТ после диализа, мг
АТ к МПО	0,26		1,7	0,305		2,35
АТ к ЛФ	0,49		2,1	0,42	7,5	2,28

ВЫВОД: Поскольку на 1 мг АТ требуется для конъюгации 1,5 г пероксидазы хрена, то на 2,1 мг АТ к ЛФ и на 1,7 мг АТ к МПО требуется (1,7+2,1)*1,5=5,7 мг ПХ. Поскольку конечное содержание АТ к ЛФ и к МПО после диализа приблизительно одинаково (2,28 и 2,35 соответственно), то активированную пероксидазу, предварительно подвергнутую диализу против натрий-ацетатного буфера, добавляют в равных объемах к антителам (после диализа объем активированной пероксидазы составил 3 мл, т.е. к АТ к ЛФ и к МПО добавили по 1,5 мл активированной пероксидазы хрена).

Для перевода АТ в PBS было объединено содержимое следующих пробирок и подвергнуто диализу против 0,01 М натрий-фосфатного буфера, рН 7,4, содержащего 0,15 М NaCl в течение ночи при +4°С:

3) АТ к ЛФ – 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1', 2' и 3' (т.е. 7,2 мг на 33 мл);

АТ к МПО -3 и 2'; 4', 1'', 2'' и 3''; 4'', 1''', 2''' и 3'''; (т.е. 0,6 мг на 6 мл;1,4 мг на 12 мл; 1,1 мг на 12 мл).

Концентрацию АТ к МПО и ЛФ в объединенных элюатах до и после диализа определили по поглощению при длине волны 280 нм – 1 мг/мл дает значение оптической плотности 1,34. Результаты представлены в таблице №8.

Таблица №8.Содержание АТ к ЛФ и МПО до и после диализа против натрий-фосфатного буфера.

Типы АТ	А 280 до диализа	объем до диализа, мл	содержание АТ до диализа, мг	А 280 после диализа	конечный объем после диализа	конечное содержание АТ после диализа, мг
АТ к МПО	0,15		0,6	0,.15		0,.7
АТ к ЛФ	-----		7,2	0,.36		8,1

Дата добавления: 2015-07-20