Ход работы. Использовали готовые мазки крови человека на предметных стеклах (20 мазков)

Использовали готовые мазки крови человека на предметных стеклах (20 мазков). Фиксация препаратов осуществлялась холодным (+4ºС) ацетоном в течение 10 мин.

Препараты были разделены на пять групп:

1. К1 – контроль активности эндогенной пероксидазы (препараты 1, 2, 18).

2. К2 – контроль блокирования эндогенной пероксидазы (препараты 3, 4, 19).

3. К3 – контроль специфичности вторых антител (препараты 5, 6, 20).

4. Препараты для выявления лактоферрина (7, 9, 11, 13, 15, 17).

5. Препараты для выявления миелопероксидазы (8, 10, 12, 14, 16).

Ход работы отражен на схеме 1.

С х е м а 1

Фиксация ацетоном

	К1

Промывка PBS (3 раза по 5 мин)

Блокирование эндогенной пероксидазы

0,3% раствором H₂O₂ в метаноле (20 мин)

	К2

Промывка PBS (1 раз в течение 5 мин)

		К3

Обработка 1% BSA на PBS (60 мин)

	7, 9, 11, 13, 15, 17		8, 10, 12, 14, 16

Нанесение АТ против лактоферрина Нанесение АТ против миелопероксидазы
в 0,1% BSA на PBS (1 мкг/мл). в 0,1% BSA на PBS (1 мкг/мл).

Инкубация в течение 60 мин Инкубация в течение 60 мин

Промывка PBS (3 раза по 5 мин)

Нанесение вторых антител, конъгированных с пероксидазой хрена
в 0,1% BSA на PBS (разведение 1/300)
Инкубация в течение 60 мин

Промывка PBS (2 раза по 5 мин)

Промывка буфером для реакции (2-3 мин)

Окрашивание реакционной смесью
(10 мин, 500 мкл смеси на препарат)

Промывка H2O дист.

Результаты и обсуждение:

Рис. Иммуноцитохимия. Стекло №1 – контроль №1 – наличие эндогенной пероксидазной активности. Клетки лопнули. Слабая окраска содержимого цитоплазмы, ядро сегментарное слабоокрашенное.

Рис. Иммуноцитохимия. Стекло №3 – контроль №2 – проверка блокировки эндогенной пероксидазной активности. Очень слабая окраска цитоплазмы и ядра. Блокировка эндогенной пероксидазной активности произошла на 80%.

Рис. Иммуноцитохимия. Стекло №5 – контроль №3 – проверка неспецифического связывания вторых антител, конъюгированных с пероксидазой, в клетках крови. Отсутствие неспецифического связывания на 80%.

Рис. Иммуноцитохимия. Стекло №7 – ядро окрашено (не должно было окраситься), в цитоплазме не различаются мелкие и крупные гранулы (в мелких – ЛФ, в крупных – МПО); цитоплазма разорвана.

Рис. Иммуноцитохимия. Стекло №8 – ядро окрашено (не должно было окраситься), в цитоплазме не различаются мелкие и крупные гранулы (в мелких – ЛФ, в крупных – МПО); цитоплазма разорвана. Есть цельные клетки, в которых МПО вышла из азурофильных гранул, поэтому цитоплазма полностью окрашена.
Иммуноэлектрофорез (ракетный форез)

Дата добавления: 2015-07-20