Иммунохимическая окраска мембраны после проведения электропереноса.

Нитроцеллюлозные мембраны инкубировали в 15 мл блокирующего буфера (10 мМ трис-HCl, 100 М NaCl, pH 7,4, содержащий 3% сухого обезжиренного молока) в течение 30 минут при +37°С, при перемешивании (в термостате на качалке).

Дважды ополаскивали буфером для промывки (10 мМ трис-HCl, 100 мМ NaCl, pH 7,4, содержащий 0,1% tween-20)

Инкубировали мембрану в растворе первых антител (120 мкл антител к лактоферрину (с концентрацией 270 мкгр/мл) или 280 мкл антител к миелопероксидазе (с концентрацией 110 мкгр/мл) в конечной концентрации 1 мкг/мл) на буфере для разведения антител (10 мМ трис-HCl, 100 М NaCl, pH 7,4, содержащий 0,3% сухого обезжиренного молока) в течение 60 минут при +37°С в термостате на качалке.

Отмывали от не связавшегося антигена буфером для промывки 3 раза по 5 минут на качалке при комнатной температуре.

Мембрану инкубировали в растворе вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, разведенных в 1000 раз (30 мкл вторых антител на 2 мембраны) и стрептавидина, разведённого в 2000 раз (15 мкл стрептавидина на 2 мембраны) на буфере для разведения антител в течение 60 минут при +37°С, при перемешивании (в термостате на качалке).

На гель были нанесены следующие пробы:

1- CM

2- GM

3- HM

4- Ё

5- M (250; 150; 100; 75; 50; 37;25 кДа)

6- Ст

7- Ю

8- Э1

9- Э2

10- Э3

Примечание: при иммунохимической окраске мембран были перепутаны мембраны – мембрану с нанесенным в качестве стандарта лактоферрином обработали антителами к миелопероксидазе и наоборот, т.е. 6-е дорожки содержат отрицательный контроль.

Выводы:

-1.Все используемые нами пробы кроме стандартов белков по результатам окраски гелей Кумасси содержат большое количество белков с различными молекулярными массами.

-2. При окраске мембран Понсо на 6 дорожке (см. мембрану I-2) с нанесенным в качестве стандарта лактоферрином окрасилась единственная полоса с молекулярным весом около 80 кДа, на дорожках 1, 2, 3, 4 и 8,10 – видна полоса белка со сходным молекулярным весом (это препараты – молоко коровы, козы, человека, слезы и экстракт №1,№3).

При окраске мембран Понсо на 6 дорожке (см. мембрану II-2) с нанесенной в качестве стандарта миелопероксидазой окрасилась единственная полоса с молекулярным весом около 60 кДа, на дорожках 3, 8, 9 и 10 – видна полоса белка со сходным молекулярным весом (это препараты – молоко человека, экстракт №1, №2, №3).

- 3.Стрептавидин с пришитой пероксидазой хрена связался биотином на всех маркерах молекулярных масс, но также связался и с близлежащими участками мембраны.

.- 4. При иммунохимическом окрашивании мембраны антитела к лактоферрину связались с белком с молекулярной массой около 80 кДа в следующих препаратах: молоко человека, слезы, экстракты лейкоцитов 1 и 3 и не связались с белком на дорожке№6, где был нанесен стандарт - миелопероксидазы. Это может свидетельствовать о том, что наши антитела к ЛФ были достаточно чистыми, или/и

о том, что препарат молока человека (дорожка 3), слез (дорожка 4) и экстракты лейкоцитов 1 и3 (дорожки 8 и 10 соответственно) содержат лактоферрин, гомологичный лактоферрину человека. Препараты молока козы (дорожка 1) и коровы (дорожка 2), слюны (дорожка 7) и экстракта лейкоцитов 2 (дорожка9) не содержат или содержат очень мало лактоферрина, гомологичного лактоферрину человека.

-4. антитела к миелопероксидазе связались с двумя полосками белка с молекулярными массами около 60 и 70 кДа в экстрактах лейкоцитов 1,2 и 3 (дорожки 8, 9, 10 соответственно). Так как в состав миелопероксидазы входят субъединицы с молекулярными массами 57 и 12 кДа, можно предположить, что полоса белка с молекулярной массой около 60 кДа содержит большую субъединицу миелопероксидазы, а полоса белка с молекулярной массой около 70 кДа содержит неразъединившиеся большую и малую субъединицы миелопероксидазы. Полоса, соответствующая молекулярной массе 70 кДа менее интенсивная, т.е. DTT не полностью восстановил дисульфидные связи между большой и малой субъединицами, и МПО осталась в комплексе из 2-х субъединиц, при этом белка в полосе с молекулярной массой около 60 кДа больше, полоса, соответствующая малой субъединице не регистрируется.

Количественное определение антигенов (миелопероксидазы или лактоферрина) методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) («сандвич» вариант)

Дата добавления: 2015-07-20