Робота 53

Інгібування катехолоксидази в бананах важкими металами

До стресових факторів для рослин належать і йони важких металів, які у високих концентраціях інгібують ріст та розвиток рослин і спричиняють їхню загибель. На клітинному рівні ці елементи спричиняють порушення окисно-відновних процесів, індукуючи появу у значних кількостях вільних радикалів, інгібуючи активність низки ензимів, в т. ч. і катехолоксидази. Якщо взяти невеликий шматок фрукта і залишити його протягом деякого часу на повітрі, то пошкоджений плід через кілька хвилин стає брунатним (див. роботу №25). Реакція зумовлена активністю катехолоксидази, що перетворює катехол у жовтий пігмент за наявності кисню. Далі відбувається окиснення жовтого пігмента до коричневого меланіну.

Катехол	====>	Жовтий пігмент	====>	Коричневий Mеланін
	Катехолоксидаза		Кисень повітря

Ензим катехолоксидазу можна легко виділити із плодів банана.

Мета роботи: виділити катехолоксидазу та дослідити, як різні концентрації йонів свинцю впливають на активність цього ензиму.

Прилади та матеріали дослідження: І. Екстракція ензиму: вага; центрифуга; ступка та товкачик; марля; невелика мензурка; центрифужна пробірка; пісок; дистильована вода (25 мл); стиглий плід банана (зріз товщиною близько 1 см = 8 г); ІІ Вплив важких металів на активність катехолоксидази: м аркер (склограф); буферний розчин pH 7 (див. додаток); 0,09M (1%-ний) розчин катехолу; 0,13M (5%-ний) розчин ацетату свинцю; 2 x 10 мл шприци; 5 термостійких пробірок; 5 дослідних пробірок; 2 x 1мл піпетки; фотоколориметр; штатив для дослідних пробірок; 5 лійок; 5 паперових фільтрів; гумові рукавички.

Хід виконання роботи

І. Екстракція ензиму

1. Наважку 8 г банана розтирають у охолодженій ступці разом із невеликою кількістю піску і 25 мл дистильованої води. Отриману суміш фільтрують через марлю у мензурку. Фільтрат буде містити ензим, катехолоксидазу.

2. Іноді, для того, щоб осадити невеликі шматки плода на дно центрифужної пробірки, проводять додаткове центрифугування протягом трьох хвилин при 3-х тис об/хв Супернатант використовують для визначення активності ензиму.

ІІ Вплив важких металів на активність атехолоксидази

1. Позначають 5 термостійких пробірок літерами A, Б, В, Г та Д.

2. Відповідно до нижче наведеної таблиці, за допомогою шприца на 10 мл, додають різні об’єми буфера та ацетату свинцю до кожної з пробірок. Уважно стежать, щоб не забруднити буфер ацетатом свинцю (різні піпетки).

Дослідна пробірка	A	Б	В	Г	Д
Об’єм буфера, мл
Об’єм ацетату свинцю, мл

M Дуже обережно поводьтеся із розчином ацетату свинцю. Він ТОКСИЧНИЙ!

3. У кожну із пробірок вносять по 1 мл розчину катехолу*.

* Примітка. 1%-ний розчин катехолу придатний для використання лише протягом 2-3 днів з часу приготування, повинен зберігатися у темряві.

M УВАГА! Р озчин катехолу шкідливий. Уникайте контакту із шкірою!

4. До кожної пробірки додають по 1 мл витягу, що містить катехолоксидазу, екстраговану із банана.

5. Для спостереження більш чіткого кольору вміст кожної пробірки фільтрують через паперовий фільтр у чисту дослідну пробірку. Утворення жовтого забарвлення ілюструє наявність у банановому екстракті активного ензиму, що перетворює катехол.

6. Активність катехолоксидази можна оцінювати візуально або за допомогою фотоколориметра, визначаючи екстинкцію розчину при 440 нм.

7. Оформляють таблицю з відповідними заголовками, підсумовуючими результати.

8. Кінцеві результати подати у вигляді графіка. По горизонтальній x-осі позначити об’єм доданого ацетату свинцю, по вертикальній y-осі – Е₄₄₀.

9. Висновки.

---

Дата добавления: 2015-07-17