Сочетание масс-спектрометрии и хроматографии для определения аминокислотного состава белка

Методика анализа включает следующие операции.

К 50–100 мкг белка добавляют 16 меченных (дейтерированных) ¹⁸O амино-кислот в качестве внутреннего стандарта и высококонцентрированную соляную кислоту, содержащую 0,5–1,0 мас.% фенола, смесь выдерживают в вакууме при температуре t = 100ºС, упаривают и высушивают. Затем к остатку добавляют н-бутанол, воздействуют ультразвуком в течение 1 мин, запаивают в ампулу и выдерживают в масляной бане. После вскрытия ампулы проводят обработку смеси ангидридом трифторуксусной кислоты. Хроматографирование проводят на спиральной колонке, заполненной хромосорбом W.

В качестве примера на рис. 5.2 приведена хроматограмма, полученная при разделении гидролизата инсулина.

	Сигнал

Время, мин

Рис. 5.2. Пики н-бутиловых эфиров аминокислот: 1 – аланин; 2 – треонин;

3 – глицин; 4 – валин; 5 – лейцин; 6 – пролин

В ХХ столетии были сняты полные масс-спектры всех компонентов и по характерному для каждой аминокислоты фрагменту качественно определены изотопные отношения. Для количественного анализа использовали набор внут-ренних стандартов – меченых аминокислот.

Меченые аминокислоты могут быть получены по способу Мерфи. Он за-ключается в нагревании при 60–70 ºС 1–4 мг той или иной аминокислоты с 0,1–0,2 мл подкисленной Н₂¹⁸О в течение нескольких суток. Включение метки со-ставляет 90% [5].

Дата добавления: 2015-10-02