Забарвлення фіксованого мазка за методом Грама, мікроскопія.

Визначення форми бактерій та тинкторіальних властивостей»

Мета:	Метод Грама називають диференціальним. Він дає змогу розрізнити окремі групи бактерій за тинкторіальними властивостями.
ПРИЗНАЧЕННЯ:	Під час фарбування за Грамом бактерії поділяють на дві групи – грампозитивні (забарвлюються у фіолетовий колір), та грамнегативні (забарвлюються у червоний колір). Здатність мікроорганізмів сприймати барвники називають тинкторіальною властивістю.
ОСНАЩЕННЯ:	- карболовий розчин генціанфіолетового або папірці за Синьовим; - розчин Люголя; - метиленово-синій розчин; - 96% етиловий спирт; - розчин фуксину Пфейффера; - вода; - лоток, підставки для фарбування; - пісочний годинник; - готові мазки; - мікроскоп; - імерсійна олія; - піпетки, пінцет; - склянка з 0,2% розчином дезактину; - гумові рукавички, мило, рушник.

ЕТАПИ	ОБГРУНТУВАННЯ
І. ПІДГОТОВЧИЙ ЕТАП 1. Надягніть гумові рукавички. 2. Приготуйте карболовий розчин генціанфіолетового або папірці за Синьовим. 3. Розчин Люголя. 4. 96% етиловий спирт 5. Розчин фуксину Пфейффера. 6. Воду 7. Фільтрувальний папір 8. Лоток 9. Пісочний годинник	Метод Грама є найважливішим методом забарвлення мікробів і їх тинкторіальних властивостей.   Для фарбування беруть розведені воднофенолові розчини, які готують із насичених розчинів відповідних барвників.
ІІ. ВИКОНАННЯ НАВИЧКИ 1. Фіксований мазок покладіть на спеціальну підставку над лотком. 2. На препарат покладіть клаптик папірця за Синьовим, на який налийте 2-3 краплі води. Фарбуйте препарат 1-2 хв. 3. Зніміть папірець по Синьову, змийте барвник і, не промиваючи водою, налийте на мазок розчин Люголя на 1 хв. 4. Змийте розчин Люголя водою. 5. Знебарвлюйте препарат 96% етиловим спиртом до зникнення струмочків барвника. 6. Промийте препарат водою. 7. Нанесіть на мазок розчин фуксину Пфейффера на 1-2 хв. 8. Змийте барвник, промийте препарат водою, висушіть. 9. Нанесіть на забарвлений мазок імерсійну олію. 10. Проведіть мікроскопію препарату. 11.Визначте морфологію бактерій і тинкторіальні властивості.	Метод розроблено Крістіаном Грамом в 1889 році. Принцип методу полягає в тому, що грампозитивні бактерії здатні утворювати міцну сполуку за генціанфіолетовим та йодом, яка не вимивається з бактерій спиртом, отже вони забарвлюються в темно-фіолетовий колір. У грамнегативних бактерій компонент вимивається спиртом, тому вони потім забарвлюються фуксином в червоний колір.   Грампозитивні – стафілококи, стрептококи, пневмококи, сарцини, клостридії, а також дифтерійні та туберкульозні палички. Грамнегативні – гонококи, менінгококи, кишкові палички, сальмонели, збудники дизентерії, рикетсії, всі звивисті бактерії та інші.
ІІІ. ЗАКІНЧЕННЯ НАВИЧКИ 1. Після закінчення роботи підніміть тубус, зніміть препарат, занурте його у 0,2% розчин дезактина. 2. Обережно витріть серветкою об’єктив, поверніть вбік, опустіть тубус. 3. Проведіть обробку рук, вимийте руки з милом.	Знижується ризик інфікування.   Миття рук є найбільш важливою процедурою для запобігання внутрішньолабораторної інфекції.

Завдання №2. Під керівництвом викладача приготуйте препарати з бульйонної і агарової культур, зафіксуйте їх фізичним способом і пофарбуйте препарат за Грамом. Проведіть мікроскопію препаратів.

Завдання №3. Запишіть у щоденник метод забарвлення кислотостійких бактерій за методом Ціля-Нільсена (збудники туберкульозу, прокази, актиноміцети та ін.).

Для виявлення кислотостійких мікобактерій туберкульозу, лепри, а також деяких актиноміцетів застосовують фарбування препарату за Цілем-Нільсеном. У цих мікроорганізмів у клітинній стінці міститься багато (понад 40 %) ліпідів, воску, оксикислот, що зумовлює їх стійкість до кислот, лугів, спиртів. Вона також малопроникна для розведених барвників, тому для фарбування використовують концентрований барвник (фуксин Ціля), що містить протраву (5% фенолу). Фарбування проводять при нагріванні (в кип'ячому шарі). За таких умов всі елементи препарату (клітини макроорганізму, стороння мікрофлора і кислотостійкі мікобактерії) набувають червоного кольору. Після оброблення препарату сульфатною кислотою і водою кислотостійкі мікобактерії залишаються червоного кольору, всі інші елементи препарату знебарвлюються. Другим барвником, розведеним метиленовим синім, фарбують без підігрівання, тому він всередину клітини кислотостійких мікобактерій не проникає і вони не змінюють червоного забарвлення. Всі інші знебарвлені елементи препарату набувають синього кольору. При мікроскопії на синьому фоні видно кислотостійкі мікобактерії червоного кольору.

Завдання №4. Проведіть забарвлення кислотостійких бактерій за методом Ціля-Нільсена (збудники туберкульозу, прокази, актиноміцети та ін.).

Кислотостійкі бактерії містять велику кількість високомолекулярних ліпідів, восків і міколової кислоти і важко фарбуються звичайними аніліновими барвниками. Але при забарвленні концентрованим фуксином Ціля з підігріванням міцно утримують його і не знебарвлюються розчинами кислот, лугів і спиртів. Тому самі мікроорганізми забарвлюються у червоний колір, а інші компоненти препарату (лейкоцити, слиз, інші бактерії) при додатковому забарвленні метиленовим синім - у синій.

Алгоритм «Фарбування мазків-препаратів за методом Ціля-Нільсена»

ЕТАПИ	вказівки до виконання
І. ПІДГОТОВЧИЙ ЕТАП	1. Надягніть гумові рукавички. 2. Підготуйте: - мікроскоп; - імерсійна олія; - патологічний матеріал; - предметні скельця; - фуксин Ціля; - лужний метиленовий синій Леффлера; - 5% сірчана або соляна кислота; - спиртівка, сухий спирт, сірники; - маркер; - пінцет; - лоток для фарбування; - вода; - пісочний годинник; - гумові рукавички, мило, рушник.
ІІ. Виконання навички	1.На фіксований у полум’ї мазок із харкотиння хворого кладуть смужку фільтрувального паперу, наливають на нього фуксин Циля і забарвлюють, тричі підігріваючи до появи парів (але не доводячи до кипіння), після чого препарат із фарбою залишають ще на 1-2 хвилини для охолодження, знімають папірець, промивають водою.

ЕТАПИ	вказівки до виконання
	2. Препарат знебарвлюють 5% сірчаною або соляною кислотою (10-30 сек.) і декілька разів промивають водою). 3. Наносять на препарат декілька крапель розчину метиленової синьки Леффлера на 1-2 хвилини, промивають водою, висушують, мікроскопують у імерсійній системі.
ІІІ. ЗАКІНЧЕННЯ НАВИЧКИ	1. Продезінфікуйте робоче місце. 2. Проведіть обробку рук, вимийте руки водою з милом. 3. Висушіть руки, змастіть їх кремом для рук.

Завдання №5. Ознайомтесь з методиками фарбування препаратів для виявлення капсул, спор, включень. Проведіть забарвлення препаратів за методами Буррі-Гінса, Ожешко, Нейссера. Проведіть мікроскопію препаратів.

ЕТАПИ	вказівки до виконання
Проведіть забарвлення препарату за методом Буррі-Гінса (для визначення капсули).	Для виявлення капсул препарат фарбують за Буррі-Гінсом. Для цього на предметному склі культуру змішують із краплею чорної туші, потім роблять мазок іншим предметним склом (як мазок із крові), висушують на повітрі, фіксують хімічним способом і, після промивання водою, наносять фуксин Пфейффера. Потім знову промивають водою і висушують на повітрі. Капсули містять понад 98% води, тому погано утримують барвник. На темному фоні препарату капсули залишаються безбарвними, клітини бактерій набувають червоного кольору. Методика забарвлення: - на лівий кінець предметного скла капають краплю розведеної 1:10 туші і вносять за допомогою бактеріальної петлі досліджувану культуру, ретельно розтирають. Покривним склом роблять мазок (подібно до мазка крові); - мазок фіксують у суміші Никифорова; - забарвлюють фуксином Ціля, розведеним 1:3 протягом 3-5 хвилин; - ретельно промиваємо водою, висушуємо і мікроскопуємо в імерсійній системі.
Проведіть забарвлення препарату за методом Ожешко (для визначення спор).	Щоб барвник проник всередину спори, перед фарбуванням мазок обробляють кислотою для розпушування оболонки спори. Після промивання водою його фіксують і фарбують за методом Ціля-Нільсена. Вегетативні клітини набувають синього кольору, спора — червоного. Принцип методу оснований на дії протрав, які розрихлюють міцні оболонки спор і полегшують проникнення барвників. Методика забарвлення: - на приготований незафіксований густий мазок спороносної культури бактерій наливають 0,5% розчин соляної кислоти і підігрівають 3-4 рази над полум'ям спиртівки до появи парів (протрава); - препарат промивають водою, висушують фільтрувальним папером і фіксують у полум’ї спиртівки; - препарат забарвлюють за методом Ціля-Нільсена. Тіла бактерій фарбуються у голубий колір, спори – у червоний.

ЕТАПИ

вказівки до виконання

Проведіть забарвлення препарату за методом Леффлера (для виявлення зерен волютина).

У процесі життєдіяльності бактерій у цитоплазмі з’являються метахроматичні (волютинові) зерна, які є запасною поживною речовиною. Так їх назвали тому, що вони забарвлюються у тон, що відрізняється від основного кольору поліхромного барвника. Наприклад, при фарбуванні метиленовим синім зерна набувають пурпурово-синього кольору через надзвичайно сильну спорідненість їх з азурами, які завжди присутні у метиленовому синьому. Зерна волютину розташовані переважно по полюсах бактерій і у збудника дифтерії є диференційною ознакою. Методика забарвлення: - фіксований мазок забарвлюють лужним спиртово-водним розчином метиленового синього протягом 4-5 хвилин; - висушують і мікроскопують. При цьому волютинові зерна забарвлюються у темно-синій, а цитоплазма - в біло-голубий колір.

Проведіть забарвлення за методом Романовського-Гімзи (для виявлення паразитів крові – малярійних плазмодіїв, трипаносом, лейшманій).

Метод застосовують для виявлення токсоплазм, спірохет, рикетсій, личинок нематод, тощо. Методика забарвлення: - мазки-препарати фіксують метанолом протягом 3-5 хв.; - висушують на повітрі; - розчин барвника Гімзи наносять на мазок. Забарвлення триває від 30 хв. до двох і більше годин; - барвник зливають, препарат промивають водою; - залишають для висихання; - за допомогою мікроскопа проводять мікроскопію препаратів. Поліхромний барвник Романовського-Гімзи фарбує цитоплазму в голубий колір, а ядра клітин, тіла бактерій, їх капсули, слиз – у червоний.

Метод Нейссера використовують для виявлення зерен волютину (у коринебактерій дифтерії).

Для виявлення включень препарат фарбують за Нейссером. 1. Надягніть гумові рукавички. 2. Для забарвлення необхідні:

1) метиленовий синій	- 0,1 г
2) еталон 96%	- 2 мл
3) льодяна оцтова кислота	- 5 мл
4) дистильована вода	- 100 мл
1) везувін	- 12 г
2) етанол	- 60 мл
3) дистильована вода	- 40 мл
1) хризоїдин	- 1 г
2) дистильована вода	- 150 мл
3) барвник розчиняють у киплячій воді

Методика забарвлення:

- на фіксований препарат наносять оцтовокислу синьку Нейссера і фарбують протягом 1 хв.;

- барвник зливають, препарат промивають водою;

- після промивання водою діють на мазок розчином Люголя (20-30 сек.);

- не промиваючи препарат водою, наносять барвник везувіну (або хризоїдину) і забарвлюють протягом 1-3 хв.;

ЕТАПИ

вказівки до виконання

- забарвлений мазок знову промивають водою; - висушують і проводять мікроскопію. Цитоплазма бактерійних клітин набуває жовто-коричневий відтінок, метахроматичні зерна — темно-синій.

Завдання №6. Проведіть дезінфекцію робочого місця, рук.

Завдання №7 Оформіть щоденник. Зробіть висновки.

Література:

Ситник І.О., Климнюк С.І., Творко М.С. «Мікробіологія, вірусологія, імунологія», стор. 57-62.

Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. «Практична мікробіологія», стор. 35-40.

Люта В.А., Кононов О.В. «Практикум з мікробіології», стор. 32-35.

Дата добавления: 2015-09-06