Задание 5. Количественное определение концентрации белка биуретовым методом

Принцип метода: Метод основан на образовании в щелочной среде окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей белков с ионами двухвалентной меди. Существуют 2 разновидности метода: при одной из них определяют от 2 до 10 мг белка в пробе; при другой (микрометод) - от 0,1 до 2 мг. Для протекания этой реакции необходимо наличие, по крайней мере, двух пептидных связей:

Комплексное соединение, образующееся в результате взаимодействия белков с биуретовым реактивом

Колориметрический анализ проводят сравнением поглощения света исследуемым раствором с поглощением проб стандартного ряда (калибровочная кривая). В качестве стандарта часто используют раствор бычьего сывороточного альбумина в воде или буферном растворе.

Ход работы:

1. Производят разбавление стандартного белкового раствора с концентрацией 2 мг/мл следующим образом:

№ пробы	Объем раствора белка, мл	Объем дист. воды, мл	Концентрация белка, мг/мл	Содержание белка в пробе, мг	Ед. погло-щения (OD)
	–	3,0	–	–
	0,3	2,7	0,2	0,6
	0,6	2,4	0,4	1,2
	0,9	2,1	0,6	1,8
	1,5	1,5	1,0	3,0
	2,0	1,0	1,32	4,0
	3,0	–	2,0	6,0
8(задача)	3,0	–	?	?

Проба №1 содержит вместо белка воду и называется контрольной. Объем всех исследуемых проб должен быть одинаковым и в данном случае составляет 3 мл.

2. Во все пробы добавляют по 2 мл биуретового реактива, тщательно перемешивают и выдерживают 30 мин при комнатной температуре.

3. После этого пробы фотометрируют на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм (500-560 нм, зеленый светофильтр) против фотометрического контроля, которым является проба №1. Показания прибора (оптическая плотность, OD, А) заносят в таблицу и затем строят калибровочную кривую, откладывая по оси ординат значения оптической плотности, а по оси абсцисс - концентрацию (или содержание) белка. Калибровочный график должен иметь вид прямой, выходящей из начала координат.

4. Параллельно с пробами для калибровочной кривой ставятся и опытные пробы *. Объем исследуемого белка (опытной пробы) – 3 мл.

* Необходимо помнить, что интенсивность окраски определяется концентрацией вещества, но зависит также от температуры и времени развития окраски. Поэтому опытные и стандартные пробы должны быть обработаны в строго определенных одинаковых условиях.

Расчеты концентрации белка в опытных пробах проводят, пользуясь калибровочным графиком. Если оптическая плотность пробы выходит за его пределы, необходимо заново приготовить образец белка таким образом, чтобы попасть на калибровочную кривую.

Дата добавления: 2015-09-07