Задание 2. Необратимые реакции осаждения белков

Практическое занятие №1

«Физико-химические свойства белков. Количественные (колориметрические) методы определения концентрации белка»

Задание 1. Высаливание белков. Обратимость высаливания

Высаливание – это обратимое осаждение белков с помощью больших концентраций нейтральных солей: NaCl, (NH₄)₂SO₄, MgSO₄ и др. Этот метод используется для выделения и очистки ферментов, при выделении γ - глобулиновых препаратов в медицинской практике.

Концентрированные растворы (NH₄)₂SO₄ высаливают почти все белки. Некоторые белки, например, глобулины, выпадают уже при полунасыщении растворов сернокислым аммонием. Другие белки, например, альбумины, выпадают только при полном насыщении. Хлористый натрий и сернокислый магний осаждают глобулины при полном насыщении. Для высаливания различных белков требуется разная концентрация одних и тех же солей, что позволяет выделять их фракционно.

Ход работы: К 0,5 мл неразбавленного яичного белка прибавить 3 мл воды. При этом образуется небольшое количество хлопьевидного осадка глобулинов. В пробирку наливают несколько капель насыщенного раствора сульфата аммония (NH₄)₂SO₄, после чего происходит растворение выпавшего глобулина *. К 3,5 мл полученного раствора яичного белка прибавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония. Глобулины выпадают в осадок. Если отфильтровать этот осадок и добавить сульфат аммония (сухой) до полного насыщения, то выпадет осадок альбумина.

* Обратимость высаливания белков заключается в растворении полученного осадка при последующем разведении водой или уменьшении концентрации солей диализом.

Задание 2. Необратимые реакции осаждения белков

Осторожно!!! Работа с агрессивными жидкостями

1) Концентрированные минеральные кислоты (кроме H₃PO₄) вызывают необратимое осаждение белков из растворов. Это осаждение объясняется как явлениями дегидратации белковых частиц, так и рядом других причин, например, образованием солей и др. Избыток концентрированной минеральной кислоты: серной, соляной и др., за исключением азотной кислоты, растворяет выпавший осадок белка.

Ход работы: К 1 мл концентрированной азотной кислоты с помощью пипетки осторожно добавляют по стенке пробирки 1 мл раствора белка. На границе соприкосновения жидкостей появится белое кольцо денатурированного белка.

2) Белки из раствора могут осаждаться и органическими кислотами, например, трихлоруксусной CCl₃COOH и сульфосалициловой C₆H₃(OH)(COOH)SO₃H. Они являются очень чувствительными и специфическими реактивами на белок и широко применяются для осаждения белков из биологических жидкостей. Трихлоруксусная кислота в конечной концентрации 2,5-5% часто применяется для полного удаления белков из растворов.

Ход работы: В две пробирки наливают по 2 мл раствора белка и добавляют в первую пробирку 3-4 капли сульфосалициловой кислоты, а во вторую пробирку 3-4 капли 8%-ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ) СС1₃СООН. В обеих пробирках белок выпадает в осадок.

3) Многие органические растворители: спирты, ацетон, эфир и др. осаждают белки. Механизм их действия объясняют связыванием воды, что ведет к дегидратации белков и понижению их устойчивости в растворе.

Ход работы: В пробирку наливают 1 мл раствора белка и по стенке осторожно добавляют 0,5 мл ацетона. На границе соприкосновения двух жидкостей появится белое кольцо денатурированного белка.

Дата добавления: 2015-09-07