Особливості отримання ікри і характеристика ембріонального розвитку зародків в’юна

Об’єктом досліджень були зародки прісноводної риби в’юна Misgurnus fosslis L., які широко використовуються при дослідженні ряду проблем сучасної біології, у тому числі в ембріологічних, біохімічних, цитологічних, біофізичних та інших дослідженнях [11].

Відносно коротка тривалість періоду ембріогенезу цього виду, легкість одержання статевих продуктів і відсутність особливих труднощів в утриманні цих риб у лабораторних умовах пояснюють його популярність.

В’юн Misgurnus fossilis L. відноситься до родини в’юнових Cobitidae, ряду Карпоподібних Cypriniformes, надряду кісткових риб Teleоstei.

У природних умовах в’юн нереститься в першій половині травня при температурі води 13-140С. Відлов особин проводять з жовтня. У лабораторних умовах ікру можна отримати регулярно з жовтня по червень.

Яйцеклітини в’юна по характеру розподілу в них цитоплазми та жовтка відносяться до типу телолецитальних, а по співвідношенню цих компонентів – до поліплазматичних. Діаметр зрілої яйцеклітини (без оболонки) складає 1,17 – 1,30 мм. Оболонка яйця складається з добре розвинутої zona radiata і зовнішньої оболонки ворсинчастої будови. Ворсинки маленькі, злегка виступають над поверхнею оболонки, а при попаданні у воду стають клейкими і служать для прикріплення яєць до субстрату. Оболонка дозрілого ооцита в’юна, білкового походження, але між zona radiata і ворсинчастим шаром є тонка оболонка, яка містить багато полісахаридів. Білки, які входять до складу zona radiata, нерозчинні в водних і сольових розчинах, але розчиняються під дією трипсину [11].

У ділянці анімального полюса яйцеклітини в’юна знаходиться одне мікропіле, і являє собою лійкоподібне заглиблення поверхні оболонки, яке переходить в короткий канал. Цей каналець відкривається в цитоплазму на внутрішній поверхні zona radiata, причому діаметр кінцевого каналу відповідає діаметру головки спермія в’юна.

На анімальному полюсі, у ділянці мікропіле, розташоване ядро на стадії метафази ІІ, а біля поверхні цитоплазми знаходиться шар кортикальних альвеол. Центральна частина яйцеклітини заповнена дейтоплазматичним включенням (жовтком). В ооциті білковий жовток накопичується у вигляді гранул, які можуть досягати діаметру 4,5-4,8 мкм, а при дозріванні яйцеклітин вони залишаються у вигляді окремих структур. Жирові крапельки в жовтку відсутні.

Запліднення у в’юна зовнішнє, моноспермне. У перші секунди після запліднення жовткова оболонка відділяється від поверхні яйця і утворює перивітеліновий простір. Одночасно розпочинається стягування цитоплазми до анімального полюса яйця й утворення цитоплазматичного горбика. Тонкий шар цитоплазми оточує жовток, і, крім того, тонкі її тяжі пронизують жовток, анастомозують між собою та утворюють у середині жовтка тонку сітку. Після відділення оболонки і утворення перивітелінового простору діаметр заплідненого яйця дорівнює 1,69 мм, а діаметр власне яйця (без оболонки) 1,1 – 1,3 мм. Висота бластодиска складає 0,35 – 0,45 мм [6].

Для експерименту використовували яйцеклітини і зародки в’юна Misgurnus fossilis L., які отримували і запліднювали за методикою А.А.Нейфаха. У лабораторних умовах риб тримали в холодильнику при температурі +4-50С. Для отримання ікри самкам внутрішньом’язово вводили хоріогонічний гонадотропін за 36 годин до проведення експерименту. Залежно від пори року і розмірів самки доза гормону складала від 500 з жовтня до 250 міжнародних одиниць з лютого по червень. Овуляція наступала через 36-40 годин при температурі ⁺19÷⁺200С. Самця декапітували, сім’яники подрібнювали і заливали відстояною водопровідною водою. Запліднення ікри проводили в чашках Петрі, добавляючи суспензію сперміїв. Для задовільного запліднення ікри потрібен її контакт із спермою 5-10 хв. Потім запліднену ікру відмивали від сперміїв і інкубували при температурі ⁺21 - ⁺220С в розчині Гольтфретера. Стадії розвитку контролювали візуально під бінокулярним мікроскопом МБС-9 [18].

Для отримання маси клітин зародків на певному періоді клітинного циклу, що являється необхідною умовою для проведення багатьох біохімічних та біофізичних досліджень, використовували штучну синхронізацію поділів клітин. Синхронізація клітинних поділів короткочасною зміною температури, на прикладі ембріональних клітин, здійснюється за допомогою температурних шоків. Зародки в’юна на стадії середньої бластули, які розвивалися при температурі 180С, поміщали на дві години в холодильник (⁺30С). Через 15 хв після підвищення температури до 180С, спостерігали максимум мітотичного індексу клітин зародків (50%). Наступний пік мітотичної активності спостерігався через 25-30 хв після першого і був значно нижчий (18%).

Після одногодинної інкубації зародків при температурі 21,50С появляються перші 2 бластомери, борозна першого поділу проходить меридіально. У подальшому вік зародків вимірюється величиною τо – умовних одиниць "Детлаф". Величина τо – тривалість одного мітотичного циклу в період синхронних поділів бластомерів становить 31±2 хв. Через півтора години після запліднення зародки представлені 4 бластомерами; борозна другого поділу проходить теж меридіально, але перпендикулярно борозні першого поділу. Вісім бластомерів з’являються на стадії 4τо, 16 бластомерів – на стадії 5τ_о. Через 3 години після запліднення зародки представлені 32 бластомерами, але борозни 5 поділу проходять паралельно екватору жовтка, в результаті чого утворюється "шапочка" на анімальному полюсі, тобто бластодиск, клітини якого не відділені від жовтка мембраною. Після цієї стадії клітини нижнього шару дотикаються до жовтка безпосередньо своєю базальною частиною, а верхні оточені зі всіх сторін ПМ. Вперше проявляються якісні відмінності між бластомерами на стадії 7τо, коли зародки представлені 64 бластомерами, які розміщенні у 2-3 шари, утворюючи "високу шапочку". На стадії 8τ_о зародки складаються із 128, а на стадії 9τ_о – 256 бластомерів, які утворюють морулу. Після цієї стадії спостерігається десинхронізація каріокінезу в клітинах. Через 6 годин після запліднення розпочинається асинхронний поділ ядер [11].

Дата добавления: 2015-07-17