Реактиви

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ОБГОВОРЕННЯ

3.1. Активність Na⁺/K⁺-АТФази в’юна misgurnus fossilis L. впродовж раннього ембріогенезу при різній тривалості інкубації та за умов дії НІЛВ

Встановлено, що залежність ферменту від співвідношення [Na⁺/K⁺] змінюється під впливом низькоінтенсивного лазерного випромінювання (НІЛВ, гелій-неонове випромінювання), як прикладу фізичного фактора [24]. З'ясування механізмів регуляції поділу клітин – один з важливих напрямків досліджень сучасної біології. Особливої уваги заслуговують зародкові клітини - бластомери, початкові стадії дроблення яких є чітко синхронізованим ритмічним процесом, що протікає з максимальною швидкістю для кожного виду тварин [11].

Згідно даних літератури, для Na⁺/K⁺-помпи характерний складний механізм регуляції її ферментативної активності, який в більшості випадків in vivo проходить на рівні біосинтезу, тобто підвищення інтенсивності експресії молекул ферменту з пропорційним їх вмонтуванням у плазматичних мембран клітин.

Встановлено, що активність Na⁺/K⁺–активованої, Mg²⁺–залежної –АТФази зародків в’юна в нормальних умовах зростає протягом ранніх етапів ембріогенезу [7]. Подібні результати були отримані на зародках морських їжаків при вивчені характеру змін Na⁺/K⁺–АТФазної активності зародків [5].

При дослідженні кінетики накопичення продукту (Р_і) Na⁺/K⁺–активованого, Mg²⁺–залежного гідролізу АТФ, впливаючи НІЛВ протягом п’яти хвилин, тривалість інкубації змінювали в діапазоні 4÷20 хв (інтервал часу інкубації становив 1 хв). Відомо, що досліджуваний фермент має два активні центри з різною спорідненістю до нуклеозидтрифосфату на різних стадіях ембріогенезу. Одержані результати свідчать про те, що лінійна залежність ферментативного гідролізу АТФ під впливом НІЛВ виходить на плато після 10 хв (час інкубації 11-20 хв.), що відбувається набагато швидше, у порівнянні з гідролізом АТФ за нормальних умов.

На стадії 2 бластомерів сопстерігається поступове підвищення активності ферменту за тривалості інкубації від 4 до 10 хв. При 10-11 хв ферментативного гідролізу АТФ відбувається повне насичення першого активного центру Na⁺/K⁺-АТФази за нормальних умов. Починаючи з 12 хв, імовірно, насичується субстратом другий активний центр АТФази зародків. Ці ж зміни ферментативної активності відбуваються і на опроміненій НІЛВ Na⁺/K⁺-АТФазі, однак повне насичення першого, та початок насичення другого активного центру спостерігається на 9-10 хв. Максимальну активність АТФази зародків виявлено на 17 хв ферментативного гідролізу, яка становить 13,5±0,297 мкмоль Р_і/год на 1 мг білка, для нормального ферменту, та на 13 хв – 9,079±0,127 мкмоль Р_і/год на 1 мг білка, для опроміненого. Активність виходить на плато на 17 хв, для нормальної Na⁺/K⁺-АТФази, а опроміненої – 13 хв.

Рис. 3. Активність Na⁺/K⁺-АТФази зародків в’юна на стадії першого поділу під впливом НІЛВ протягом 5 хв.: тут і надалі вірогідні зміни у порівнянні з контролем (15 хв):

* – Р >0,05;** – Р >0,01; *** – Р >0,001.

Виходячи з даних досліджень, ми можемо стверджувати що спорідненість активних центрів до субстрату знижується у опроміненого ферменту, порівнюючи з активністю ферментативного гідролізу нормальної Na⁺/K⁺-АТФази.

Аналогічні зміни відмічено і на стадії 64 бластомерів при інкубації від 4 до 11 хв. При 11-12 хв ферментативного гідролізу АТФ відбувається повне насичення першого активного центру Na⁺/K⁺-АТФази за нормальних умов. Починаючи з 13 хв, насичується субстратом другий активний центр АТФази зародків. Такі ж зміни ферментативної активності відбуваються і на опроміненій НІЛВ Na⁺/K⁺-АТФазі, однак повне насичення першого, та початок насичення другого активного центру спостерігається на 9 хв. Максимальну активність АТФази зародків виявлено на 15 хв ферментативного гідролізу, яка становить 17,7±0,2 мкмоль Р_і/год на 1 мг білка, для нормального ферменту, та на 13 хв – 8,672±0,179 мкмоль Р_і/год на 1 мг білка, для опроміненого. Активність виходить на плато на 15 хв, для нормальної Na⁺/K⁺-АТФази, а опроміненої – 12 хв.

Рис. 4. Активність Na⁺/K⁺-АТФази зародків в’юна на стадії шостого поділу під впливом НІЛВ протягом 5 хв.

Рис. 5. Активність Na⁺/K⁺-АТФази зародків в’юна на стадії десятого поділу під впливом НІЛВ протягом 5 хв.

На стадії 2 бластомерів сопстерігається поступове підвищення активності ферменту за тривалості інкубації від 4 до 6 хв. Починаючи з 9 хв, насичується субстратом другий активний центр АТФази зародків. Ці ж зміни ферментативної активності відбуваються і на опроміненій НІЛВ Na⁺/K⁺-АТФазі, однак повне насичення першого, та початок насичення другого активного центру спостерігається на 8 хв. Максимальну активність АТФази зародків виявлено на 14 хв ферментативного гідролізу, яка становить 12,7±0,2 мкмоль Р_і/год на 1 мг білка, для нормального ферменту, та на 10 хв – 7,94±0,11 мкмоль Р_і/год на 1 мг білка, для опроміненого. Активність виходить на плато на 14 хв, для нормальної Na⁺/K⁺-АТФази, а опроміненої – 10 хв.

3.2. Активність Na⁺/K⁺-АТФази в’юна Misgurnus fossilis L. впродовж раннього ембріогенезу при різних температурних значеннях середовища інкубації та за умов дії НІЛВ

Проведено оцінку визначення температурної залежності активності ферменту за умов впливу низькоінтенсивного лазерного випромінювання (НІЛВ) червоного діапазону, тривалістю експозиції 5 хв, як прикладу фізичного фактору. При дослідженні кінетики накопичення продукту (Р_і) Na⁺/K⁺–активованого, Mg²⁺–залежного гідролізу АТФ, за умов впливу НІЛВ протягом п’яти хвилин, температуру змінювали у діапазоні 19÷26°С (тривалість інкубації становила 15 хв).

Рис. 6. Активність ферментативного гідролізу Na⁺/K⁺-АТФази мембран зародків в’юна Misgurnus fossilis L. на стадії 2-х бластомерів при різних температурних значеннях середовища інкубації та за умов дії НІЛВ.

На стадії 2 бластомерів спостерігається куполоподіна залежність активності ферменту за інкубації при значеннях температури середовища від 19 до 26 °С. Максимальну активність АТФази зародків виявлено при температурі 23 °С, яка становить 11,609±0,867 мкмоль Рі/год на 1 мг білка, n=9.

На стадії 64 бластомерів також спостерігається куполоподіна залежність активності ферменту. Максимальну активність АТФази зародків виявлено при температурі 22 °С, яка становить 23,127±0,571 мкмоль Рі/год на 1 мг білка, n=9, та є значно вищою, за активність при нормальних умовах.

Рис. 7. Активність ферментативного гідролізу Na⁺/K⁺-АТФази мембран зародків в’юна Misgurnus fossilis L. На стадії 64-х бластомерів при різних температурних значеннях середовища інкубації та за умов дії НІЛВ.

Рис. 8. Активність ферментативного гідролізу Na⁺/K⁺-АТФази мембран зародків в’юна Misgurnus fossilis L. На стадії 10-го поділу бластомерів при різних температурних значеннях середовища інкубації та за умов дії НІЛВ.

Подібні зміни спостерігаються на стадії 10-го поділу, проте активність дослідного ферменту є значно нижчою, порівняно з контролем, на усіх етапах дослідження. Максимальну активність АТФази зародків виявлено при температурі 23 °С, яка становить 10,190±0,102 мкмоль Рі/год на 1 мг білка, n=9.

Дата добавления: 2015-07-17