Механізм функціонування.

Як типова АТФаза Р-типу, Na⁺/K⁺-АТФаза володіє здатністю перебувати у двох основних конформаціях, володіючих високою спорідненістю до іонів натрію (Е₁) або калію (Е₂). Вихідною конформацією можна вважати Е₁, оскільки близько 70% цих молекул у цій конформації в середовищі, де відсутній і натрій, і калій [9].

Нехай спочатку в насосі «сидять» три іони натрію на своїх сайтах зв’язування і один протон на глутаматному залишку. Іони натрію можуть вийти у позаклітинне середовище тільки тоді, коли С-кінець білка поміняє своє положення і перестане затикати іонний канал і по цьому каналу піде вода, яка протонує залишок аспартату (де знаходиться сайт зв’язування для натрію). Коли іони натрію виходять у позаклітинне середовище, їм змінюють іони калію. Той протон, що був на глутаматі, переходить на аспартату, а той, що був на аспартаті, покидає білок через відкритий іонний канал. Іони калію входять у внутріклітинне середовище через один канал, а протон, який був на аспартаті, ˗ через інший. На зміну іонам калію приходять іони натрію. На глутаматний залишок приєднується протон, і цикл повторюється [41].

Рис. 2. Механізм роботи Na⁺/K⁺-АТФази. Зелені кружки – іони натрію, червоні квадратики – іони калію, чорні кружки з плюсом всередині – протони, голубі шарики – вода, червоний циліндр – С-кінець білка; римськими цифрами показано сайти зв’язування іонів, Е1Р, Е2Р і т д. – так називається стан АТФази; D930 – залишок аспартату, з яким зв’язується один із протонів, E958 – залишок глутамату, з яким зв’язується інший протон, Y1020 – залишок тирозину розміщений на С-кінці білка [41].    

1.2.3. Ізофенменти Na⁺/K⁺-АТФази.

У 1959 році Маркерт і Моллер вперше використали термін «ізоферменти» для опису окремих білків, які каталізують ті ж біохімічні реакції. З тих пір вчені шукали структурні варіанти ферментів, щоб зрозуміти їх фізіологічні функції. У деяких випадках дублювання генів або альтернативної посттранскрипційної обробки повідомлень гена призводить до утворення ізоферментів з унікальними біологічними властивостями. Розвиток декількох ізоферментів часто забезпечує функціональну універсальність клітин необхідну для виконання своїх фізіологічних потреб.

Як і у випадку багатьох інших основних білків у клітині, Na⁺/K⁺-АТФаза виражається у вигляді декількох ізоферментів. Дійсно, існують різні гени, що кодують різні молекулярні форми як α-, так і β-поліпептидів. Найбільш ранні свідоцтва структурних варіантів Na⁺/K⁺-помпи було знайдено в Artemia. У цих ракоподібних, α-субодиниці розділені на дві різні форми у SDS-поліакриламідному гелі. Вперше продемонстрував ізоформи Na⁺/K⁺-АТФази у ссавців Сведнер, який виявив дві форми α-субодиниці: вже відому ниркову α-форму і форму мозку, що назвали α⁺. Ця нова каталітична субодиниця повільніше переміщувалася SDS-поліакриламідному гелі, але була чутливішою до уабаїну. Таким чином, було показано що α⁺ відзначалася більш високою реакційною здатністю по відношенню до N-етилмалеміду, більш високою чутливістю до похідних вітаміну піротіаміну, і підвищеною стійкістю до трипсину порівняно з α-ізоформою. Ці властивості відзначали різні структурні відмінності між ізоформами. Пізніше, було продемонстровано відмінності у NH₂-кінцях α⁺ і α і запропоновано різницю у генетичних основах ізоформ. Поява методів молекулярної біології привела до ідентифікації щонайменше трьох α-поліпептидів у хребетних. В даний час відомо як α1, α2, α3. Зовсім недавно, Шамрай та Лінгрел визначили четверту α-ізоформу (α4) у насінниках щурів [36].

α-ізоформи Na⁺/K⁺-АТФази клоновані з декількох видів ссавців. Аналіз філогенетичного розподілу α-білків з використанням антитіл, спрямованих до консервативних і конкретних ділянок ізоформ вказує, що, можливо, ізоформи існують у всіх ссавців, у тому числі і плацентарних і сумчастих видів. Ідентифікація Na⁺/K⁺-помпи α-ізоформ в курячих і костистих риб показує їх повсюдну наявність серед хребетних [44]. Крім того, відкриття α-ізоформ у ракоподібних, гідри і плоских червів показує, що розбіжність генів Na/K-АТФази, можливо, сталася на початкових етапах еволюції.

Подальші дослідження показали, що молекулярна різноманітність Na⁺/K⁺-помпи також поширюється на його β-субодиницю. В даний час в трьох різних Na⁺/K⁺-АТФазах були ідентифіковані β-ізоформи. Дві ізоформи, β1 і β2, були знайдені в різних тканинах ссавців і птахів, тоді як β3 була виявлена в амфібій, миші, щура та людини.

Повну амінокислотну послідовність α-ізоформи було встановлено з кДНК, що кодують поліпептиди у щура, курчати і людини. α3-ізоформа є найменшою і складається з 1014 амінокислотних залишків, α1 - 1024, α2 - 1021, і α4 - 1028. Дослідження амінокислотної послідовності, сайт-специфічного маркування та імунологічного та протеолітичного розщеплення забезпечило деяке уявлення про можливу орієнтацію трансмембранної α-субодиниці. Ці дослідження виявили NH₂-кінцевій сегмент з чотирьох трансмембранних проміжних областей, великий цитоплазматичний домен, що складається з, приблизно, однієї третини поліпептиду і карбокси-кінцеву ділянку, що містить 6 мембранних проміжних областей.

У всіх видів ступінь ідентичності по α1- і α2-ізоформах складає ~ 92%, і більше 96% з α3. Існує також високий ступінь ідентичності (≈ 87%) серед α1-, α2-і α3-ізоформ. На противагу цьому, α4 є найбільш суперечливою, оскільки ступінь ідентичності з α1-ізоформою становить 78%.

Амінокислотні послідовності β-ізоформ були вивчені з кДНК пацюків, людини, курки, жаби і миш [39]. У щурів β1-ізоформа містить 304, β2-ізоформа – 290 і β3-ізоформа – 279 амінокислот. Всі β-ізоформи мають спільну основну структуру. β-ізоформи складаються з короткої NH₂-кінцевої цитоплазматичної ділянки, трансмембранного сегменту, а також великого позаклітинного домену. Гомологія β1-і β2-ізоформи для всіх видів ссавців складає ~ 95%. У інших тварин ця величина падає до 60%. У порівнянні з β1-, β2-поліпептид демонструє 58% подібності (34% ідентичністю 24% функціональною подібністю), тоді як β3-субодиниці становить 68% гомології з ідентичністю 39%. Подібність між β2 і β3 досягає 61%, при цьому 49% залишків зберігається. Цікаво, що у β2-субодиниці первинна структура більш тісно пов'язана з β-ізоформою H⁺/K⁺-помпи, ніж до β1-ізоформи, припускаючи, що гени β2 і β-ізоформи Н⁺/К⁺-АТФази розійшлися пізніше, ніж β1 і β2. Трансмембранний домен β-субодиниці є найбільш консервативною областю, як серед ізоформ, так і серед видів [31].

Усі β-ізоформи сильно глікозильовані. β1-ізоформи у ссавців мають три N-пов'язаних сайти глікозилювання. Ймовірні N-пов'язані сайти глікозилювання до β2-ізоформи варіюють залежно від виду. Таким чином, субодиниця курки має чотири потенційних сайти глікозилювання, щур має сім, людина має вісім, і миша має дев'ять β2-поліпептидів [44]. Інгібування глікозилювання β1-субодиниці Na⁺/K⁺-АТФази з тунікаміцину призводить до утворення Na⁺/K⁺-АТФази з нормальною спорідненістю до уабаїну. Експресія ферменту, в якому всі β-субодиниці N-пов'язаних сайтів глікозилювання мутують також робить його активним зберігаючи спорідненість до K⁺ і уабаїну. Проте, зниження в здатності неглікозильованої β-субодиниці збирати α-субодиницю і вища чутливість ферменту до протеолізу свідчать, що глікозилювання, можливо, грає роль у згортанні білка.

Ще однією важливою особливістю в структурі β1-субодиниці є наявність трьох дисульфідних містків, які в щура поліпептиду розміщені між Cys125-Cys148, Cys158-Cys174 і Cys212-Cys275. Все це цистеїн, але їх відносні позиції в послідовності зберігаються в β2 і β3-ізоформ, що свідчить про подібність у третинній структурі поліпептидів. Вплив на Na⁺/K⁺-АТФазу відновників призводить до її інактивації, тим самим припускаючи, що дисульфідні зв'язки, необхідні для функції ферменту. Видалення всього лише одного з дисульфідних зв'язків шляхом сайт-спрямованого мутагенезу із залученням цистеїну було показано, що цього достатньо, щоб зруйнувати належну структуру α/β-субодиниці.

α1-ізоформу пов’язану з β1-субодиницею виявлено майже в кожній тканині [36].

Ферментативні властивості ізоферментів Na⁺/K⁺-АТФази. Розуміння ферментативних властивостей окремих ізоферментів може допомогти у визначенні основ для складної молекулярної різноманітності, яка характеризує Na⁺/K⁺-АТФазу.

Першою спробою оцінити каталітичні властивості ізоферментів Na-насосу було порівняння спорідненості субстрату у ферментах, отриманих з клітин нирок і мозку. Ця рання робота дала змогу припустити, що Na⁺/K⁺-АТФазні ізоферменти мають чіткі відмінності в їх спорідненості до Na⁺, K⁺, і АТФ. Сведнер [31] порівняв властивості Na⁺/K⁺-помпи з клітин аксолемми та нирок щурів. У ниркового α1/β1-ізоферменту виявлено, що спорідненість до АТФ – нижча, але до K⁺ і Na⁺ – вища, ніж у нейронів, що складаються з α2 і α3-субодиниць. Також, відмінності у спорідненості до Na⁺ або K⁺ були знайдені між частково очищеними Na⁺/K⁺-АТФазами артемії та різних тканин щура.

Інші відмінності ферментативних властивостей були знайдені в α3/β2-ізоформах Na⁺/K⁺-АТФази шишкоподібної залози, яка має більш високу Na⁺-спорідненість, ніж ниркова α1/β1-ізоформа. З іншого боку, подібна кінетика спорідненості до Na⁺ і К⁺ була у Na⁺/K⁺-помпи мозочка та гіпокампа на різних стадіях розвитку, незважаючи на варіації в кількості виражених ізоформ.

Хоча деякі дослідження свідчать про відмінності у ферментативній поведінці ізоферментів Na/K-помпи, розбіжності в результатах кінетичних параметрів призводять до невизначеності у функціональних характеристиках ізоферментів. Однак, реакційні здатності ізоформ даного ферменту до уабаїну є менш суперечливими. При широкій чутливості до кардіотонічну стероїду, це особливо очевидно на ізоферментах Na⁺/K⁺-АТФази гризунів. У щурів, наприклад, α1, як повідомлялося, в 100 разів більш стійкіша до уабаїну, ніж α⁺ (α2 та α3) [44]. На основі диференціальної чутливості до трипсину, у ранніх експериментальних даних також зазначено, що α3-ізоформа має високу спорідненість до уабаїну. Працюючи з частково очищеною Na⁺/K⁺-АТФазою зі стовбура головного мозку щурів, дослідники визначили три популяції Na⁺/K⁺-помпи з різною чутливістю до уабаїну, які можливо відповідають α1, α2 і α3 [31]. У кролика, свині, собаки і людини, відмінностей в спорідненості до кардіотонічного стероїда, можливо, немає, оскільки α1-ізоформа у цих видів є набагато більш чутливою до уабаїну.

З впровадженням методів молекулярної біології в області дослідження Na⁺/K⁺-АТФази, стало можливим більш детальне розуміння функції кожної ізоформи. Наявність кДНК для різних ізоформ ферменту дало можливість здійснити дослідження у гетерологічних експресуючих системах. Деякі дослідники використовували клітини ссавців окремо виразивши кожну ізоформу Na⁺/K⁺-АТФази [31]. Через вивчення молекулярної основи різниці чутливості до серцевих глікозидів між клітинами приматів і гризунів, було показано, що α1-ізоформа щурів, може забезпечити опірність до уабаїну уабаїн-чутливих CV-1 клітин. Використавши відмінності в уабаїн-чутливості у гризунів та інших ссавців, Джервел і Ліндгрел досліджували кінетичні властивості α1-, α2-, і α3-субодиниці щурів [44]. Змінюючи два залишки в позаклітинній петлі між першим і другим трансмембранним сегментами, α2- і α3-ізоформи стають уабаїн-стійкими. Аналіз окремих ізоферментів показав, що α1/β1 і α2/β1 показують однакову спорідненість до Na⁺, К⁺ і АТФ, тоді як α3/β1-ізофермент володіє більш низькою спорідненістю до Na⁺, в порівнянні з α1/β1 і α2/β1. Згодом, високу уабаїн-чутливість встановили для α3/β1 Na⁺/K⁺-АТФази головного мозку пацюка та серця собаки, однак, мають нижчу спорідненість до Na⁺. Щоб ідентифікувати структурну основу Na⁺-залежних ізоформ, серії химерних α1/α3-субодиниць було експресовано у клітинах HeLa. Аналіз на Na⁺-спорідненості кожної химери не дав змоги виявити області відповідальної за відмінності в Na⁺-залежності між ізоформами, однак, вказав на те, що кілька залишків охоплюють α-поліпептид, які, можливо, співпрацюють зв'язуючи і транспортуючи катіон.

Експресія гібридних Na⁺/K⁺-АТФази молекул у вигляді α- і β-ізоформ у різних видів в ооцитах Xenopus також допомагає в поясненні характеристик ізоферментів Na⁺/K⁺-АТФази. Використавши гетерологічну експресію в дріжджах, які не мають ендогенної Na⁺/K⁺-АТФази, Фарлей і його колеги успішно отримали молекулу каталітично компетентної Na⁺/K⁺-АТФази шляхом експресії α1-субодиниці від овець і β-субодиниці від собаки. Пізніше, вони встановили, що константу зв'язування уабаїну для α1 (овець) і α3 (щурів) становить від 5 до 10 нм. Крім того, спільна експресія α1- та α3-ізоформи з химерних молекул між Na⁺/K⁺- і Н⁺/К⁺-АТФазами β-субодиниць показали, що β-поліпептид модулює K⁺- і Na⁺-залежність ферменту [31].

Дата добавления: 2015-07-17