Динаміка біоелектричних та метаболічних параметрів мембран зародків протягом раннього ембріогенезу тварин

Плазматичні мембрани зародкових клітин є важливим центром морфогенетичних перебудов у ранньому ембріогенезі. Вони забезпечують вибіркову проникність для речовин, які транспортуються в процесі життєдіяльності клітин [11]. Завдяки клітинному метаболізму підтримується певний розподіл іонів між цитоплазмою та середовищем. Це створює значний заряд потенціальної енергії у вигляді трансмембранних та електрохімічних градієнтів, які можуть бути досить ефективно використані різноманітними формами клітинної активності [4].

У період дроблення для зародків різних тварин зареєстровано закономірну гіперполяризацію мембрани бластомерів з величиною приблизно від –5 – –12 мВ – перед утворенням першої борозни дроблення та до –34 – –67 мВ – на стадії середньої бластули.

Експерименти з додаванням уабаїну в зародках тритона та в’юна дали можливість встановити, що Na⁺/K⁺-АТФаза здійснює певний внесок у гіперполяризацію мембрани під час дроблення. У фізіологічних умовах рівень потенціалу змінюється від –20 до –60 мВ, а при додаванні уабаїну відбувається деполяризація мембрани, величина якої залежить від стадії розвитку [25].

Незрілі ооцити містять багато іонізованого калію і значно менше натрію, а їх мембрана більш проникна для К⁺. Іони натрію нагромаджуються в процесі дозрівання ооцитів. У зрілих ооцитів різко зменшується загальна іонна проникність мембрани. Проте в зигот на перших хвилинах розвитку збільшується проникність мембрани для натрію, яка поступово змінюється високою проникністю для калію [29].

На зародках Misgurnus fossilis L. показано, що до стадії 32 бластомерів (включно) калієва селективність мембрани періодично змінюється протягом клітинних поділів. В результаті роботи Na⁺/K⁺-помпи відбувається формування осмотичної рідини бластоцелю. Деякі автори припускають, що перерозподіл йонів може суттєво впливати на інтенсивність макромолекулярних синтезів у клітинах зародків протягом раннього ембріогенезу. Кафіані та Маленковим запропоновано гіпотезу, згідно якої саме іонний гомеостаз клітин є одним із найважливіших факторів регуляції функцій та процесів [3].

Однак, електрогенні катіони є не лише головним фактором електрогенезу, а також суттєво впливають на процеси внутрішньоклітинних синтезів і функціонування ферментативних систем [6].

Зниження концентрації внутрішньоклітинного калію веде до зупинки поділів бластомерів, гальмує синтез РНК і білка. Збільшення внутрішньоклітинної концентрації іонів калію є не тільки тригером синтезу ДНК та дроблень, а і певною компонентою мембраноспряжених процесів, які переводять клітину у новий режим функціонування [42].

У перші хвилини після запліднення різко збільшується провідність зародкових мембран для К⁺, проте активуючим фактором для яйцеклітин є “хвиля” кальцію, яка спочатку виникає на анімальному полюсі зародкової клітини і поширюється до вегетативного полюса [11]. Власне іонам кальцію відводять провідну роль у процесах раннього ембріогенезу, як універсальному месенджеру при передачі сигналів через регуляторні системи зародкових клітин. Важлива роль Са²⁺ полягає і в їх здатності до регуляції перебігу різноманітних внутрішньоклітинних процесів [30]. Із зміною концентрації внутрішньоклітинного кальцію пов’язана також і регуляція мітозу: виявлено, що Са²⁺ бере участь в процесах організації мітотичного апарату [20].

До регуляторів багатьох процесів (поділів клітин, мембранного транспорту, активності ферментів) належить внутрішньоклітинний показник протонів – pH [5]. При заплідненні яйцеклітини морського їжака виявлено періодичні коливання pH цитоплазми. Подібні результати виявили при заплідненні яйцеклітин шпорцевої жаби X. laevis. Встановлено кореляцію між рівнем pH та швидкістю поділу клітини: чим вищий pH, тим менший період поділу [28].

Протягом раннього ембріогенезу спостерігається зміна інтенсивності енергетичного метаболізму зародкових мембран [12]. Встановлено коливний характер швидкості поглинання кисню протягом синхронних поділів еластомерів зародків в’юна. Інтенсивність поглинання О₂ посилюється на стадії інтерфази, досягає свого максимуму в профазі, а його зменшення інтенсивності поглинання спостерігається на стадії телофази клітинного циклу [10]. Репін та співроб. виявили циклічні зміни метаболізму SH- груп у період дроблення морських їжаків, а також зв'язок між змінами тіолів та швидкістю синтезу білка [26].

Отже, періодичні зміни біоелектричних процесів у період дроблення зародків тварин тісно спряжені з мембранними процесами та процесами, що відбуваються у цитоплазмі та мають властивості автоколивних систем [25].

1.2. Na⁺/K⁺-АТФаза, як система первино-активного транспорту Na⁺ й K⁺

Активний транспорт – це транспорт неелектролітів та іонів проти градієнта хімічного та електрохімічного потенціалів. Цей вид транспорту пов'язаний з енергетичними затратами [17]. Розрізняють три основні типи активного транспорту іонів: натрій-калієва помпа – Na⁺/K⁺-аденозинтрифосфатаза (АТФаза); кальцієва (Са²⁺) помпа – Са²⁺-АТФаза, яка транспортує Са²⁺ із клітини або цитозолю в ендоплазматичний ретикулум; протонна помпа – Н⁺-АТФаза [2]. Активний транспорт іонів проти градієнта концентрації потребує енергії, яка виділяється при гідролізі АТФ до АДФ: АТФ = АДФ⁺Ф (неорганічний фосфат). Для активного транспорту, як і для полегшеної дифузії, характерні: специфічність, обмеження максимальної швидкості (тобто кінетична крива виходить на плато) і наявність інгібіторів.

Na⁺/K⁺-АТФазу виявлено у плазматичній мембрані фактично всіх тваринних клітин. Вона підтримує К⁺ у високій і Na⁺ в низькій концентраціях всередині клітини (порівняно із зовнішнім середовищем) [17]. Відомо, що Na⁺/K⁺-АТФаза може гідролізувати також інші нуклеотиди – ГТФ, УТФ – і забезпечувати в ході цієї реакції активний транспорт іонів натрію та калію [35]. Однак АТФ є не тільки субстратом, але і модулятором Na⁺/К⁺-АТФази, регулюючи її спорідненість до транспортуючих катіонів. Інші нуклеотиди не здатні модулювати спорідненість до транспортуючих іонів, хоча їх гідроліз також призводить до активного транспорту [7].

Іонний склад клітин (проявляють властивості живого) відрізняється від іонного складу навколишнього середовища. Найбільш істотною відмінністю є асиметрична розподіл одновалентних іонів натрію і калію.

Високе співвідношення концентрації калію у поза- і внутрішньоклітинному середовищі (1:38) підтримується завдяки роботи Nа⁺/К⁺-АТФази, активно переносить іони калію в клітину, а іони натрію - з неї (у співвідношенні 2:3 відповідно) (внаслідок активного виведення натрію з клітин Na⁺/K⁺-АТФази 85-90% всього натрію, що міститься в організмі, знаходиться в позаклітинній рідині і з цієї причини визначає її обсяг) [23].

Na⁺/K⁺-АТФаза – α/β-гетеродимерний інтегральний білок плазматичних мембран, що здійснює АТФ-залежний трансмембранний перенос Na⁺ і К⁺ в клітинах еукаріотів та прокаріот, що забезпечує підтримання електрохімічного і осмотичного градієнтів одновалентних іонів, необхідних для нормального функціонування клітин. Фермент відіграє ключову роль у реалізації численних клітинних функцій і процесів, пов'язаних з іонними градієнтами [34].

Na⁺/K⁺-АТФаза представлена глобулою, утвореною із двох пептидних ланцюгів – α/β-субодиниць [7]. Загальна молекулярна маса близько 280 кДа. У процесі роботи АТФаза поводить себе як справжня молекулярна машина [41]. Вона здійснює певні конформаційні рухи (тобто зміни просторової орієнтації структури молекул), переходячи зі стану Е₁ в стан Е₂. У результаті цього відбувається трансмембранний переносення іонів і створення активної компоненти мембранного потенціалу [23].

Активність Nа⁺/К⁺-АТФази зростає при підвищенні внутрішньоклітинної концентрації іонів натрію. Зниження її активності спостерігається при передозуванні дигоксину, а також при серцевій і нирковій недостатностях [11]. Опосередковано підвищує активність Na⁺/К⁺-АТФази інсулін. Він сприяє надходженню калію в м'язові клітини і клітини печінки, причому цей ефект не пов'язаний з впливом інсуліну на транспорт глюкози. При недостатності інсуліну, навпаки, калій виходить з клітин [19].

Катехоламіни впливають на розподіл калію по різному. Β-2-адреностимулятори підвищують активність Nа⁺/К⁺-АТФази, стимулюють секрецію інсуліну і підсилюють надходження калію в клітини, а альфа-адреностимулятори надають протилежну дію [27].

1.2.1. Молекулярна організація Na⁺/K⁺-АТФази.

Більшість АТФаз Р-типу, які виявлені в еукаріотичних організмів – це інтегральні мембранні білки з молекулярною масою приблизно 100 кДа [39].

Na⁺/K⁺-АТФаза входить до складу зовнішніх плазматичних мембран всіх тваринних клітин у якості інтегрального білка. Він забезпечує перетворення енергії АТФ в енергію градієнтів одновалентних іонів натрію ті калію у стехіометрії 1АТФ: 3 іони натрію: 2 іони калію [7].

Дві субодиниці – α і β – складають структурну і функціональну основу Na⁺/K⁺-АТФази [31]. Первинна структура обох субодиниць, які входять до складу Na⁺/K⁺-АТФази розшифрована завдяки методам генної інженерії в поєднанні з методами білкової хімії [41].

α-субодиниця (каталітична, молекулярна маса 90-100 кДа) пронизує ліпідний матрикс мембрани, утворюючи 10 α-спіральних трансмембранних сегментів протяжністю 4 нм кожен, які складаються приблизно з 20 амінокислотних залишків. Аналіз профілю гідрофобності показує, що поліпептидний ланцюг α-субодиниці Na⁺/K⁺-АТФази містить від 6 до 10 трансмембранних фрагментів, які складаються з 17-25 амінокислот, утворюють конформацію α-спіраль [41]. При цьому С- та N-кінці спрямовані у цитоплазму, й гідрофільні петлі між 2-м і 3-м та між 4-м і 5-м трансмембранними сегментами. На останній петлі розміщений активний центр ферменту. Іонні центри також розміщені на α-субодиниці [7].

N-кінцева частина поліпептидного ланцюга являє собою гнучку неспіралізовану ділянку, збагачену залишками лізину, яка бере участь у конформаційних переходах і, можливо, регулює чутливість ферменту до катіонів. У N-кінцевій частині α-субодиниці наявні 4 трансмембранні фрагменти (М1 - М4), а С-кінцевій частині – ще шість (М4 - М10). У зв’язуванні іонів беруть участь карбоксильні групи дикарбонових амінокислот, локалізованих на 3-му та 6-му трансмембранних сегментах [25].

Рис.1. Молекулярна організація Na⁺/K⁺-АТФази у плазматичній мембрані [38].

α-субодиниця відіграє важливу роль в процесі раннього розвитку зародків. Ін’єкція зародкам шпорцевої жаби X. leavis гібридизованої мРНК каталітичної субодиниці призводить до інгібування гаструляції, а при введенні в дорзальні бластомери – до зупинки диференціації головного відділу [44].

β-субодиниця Na⁺/K⁺-АТФази (~ 40-60 кДа) забезпечує модуляцію спорідненості ферменту до іонів K⁺ та Na⁺. Вона представлена трьома ізоформами. β-1 і β-2 знайдені в різних тканинах ссавців, коли β-3-ізоформа була виявлена в амфібій, гризунів і у людини [17]. β-субодиниця представлена глікопротеїном [7]. Згідно сучасних уявлень, вона забезпечує вихід α-поліпептиду з ендоплазматичного ретикулуму, його вмонтування і правильну орієнтацію в цитоплазматичній мембрані, а також формування активного ферменту [37]. β-субодиниця також модифікує каталітичні характеристики Na⁺/K⁺-АТФазного комплексу, відповідає зо його антигенні властивості і бере участь в нейрогліальній адгезії. Безпосередньої участі в каталізі і транспорті катіонів β-субодиниця не бере, однак вона необхідна для нормального функціонування Na⁺/K⁺-АТФази, вона відіграє певну роль в регуляції зв’язування K⁺ з ферментом, разом з α-субодиницею бере участь в конформаційних переходах, які індукують зв’язування Na⁺/K⁺- АТФази з різними лігандами [15].

N-кінцевий домен β-субодиниці Na⁺/K⁺-АТФази розташований в цитоплазмі, а С-кінцевий домен – із зовнішньої сторони мембрани. Більша частина β-субодиниці розташована на зовнішній стороні цитоплазматичної мембрани. Поліпептидний ланцюг β-субодиниці Na⁺/K⁺-АТФази пронизує мембрану один раз; трансмембранний сегмент знаходиться поблизу N-кінцевого домену [34].

У зовнішньоплазматичній частині поліпептидного ланцюга β-субодиниці Na⁺/K⁺-АТФази є від 3 до 6 залишків аспарагіну в послідовності Asp-Ser/Thr, які потенційно можуть бути глікозильовані. Розгалужені вуглеводневі ланцюги β1-субодиниці Na⁺ /K⁺-АТФази містять в основному галактозу, манозу і N-ацетилглюкозамін, причому для складу цукрів (вуглеводів) характерна тканина специфічність. Ступінь глікозилювання відбивається на гетерогенності β-субодиниці Na⁺/K⁺-АТФази, тому при електрофорезі β-субодиниця представлена набором білкових смуг з М = 50 - 60 кДа [35,36].

Експресія екзогенної мРНК β1-субодиниці (мишей, курчат, щурів) в ооцити X. leavis призводили до часозалежного збільшення оуабаїн-звязуючих сайтів як в плазматичних мембранах, так і внутрішньоклітинних мембранах. Дані, отримані з використанням біфункціональних агентів, свідчать про взаємодії трансмембранного сегменту β-субодиниці з М8-М10 сегментами α-субодиниці [11].

Третій білок, γ-субодиниця, також був виявлений у очищених препаратах ферменту. γ-субодиниця являє собою невеликий, гідрофобний поліпептид 8-14 кДа, який вважався забруднювачем при очищенні. Однак було показано, що він може бути ковалентно поміченим фотоафінними похідними уабаїну. Інші докази того, що γ-субодиниця є складовою частиною Na⁺/K⁺-помпи в тому, що ця субодиниця локалізується з α-субодиницею у нефроні сегментів. Крім того, високий ступінь гомології між γ-субодиницею в декількох видів дає змогу припустити, що ця структура може бути важливою у Na⁺/K⁺-АТФазі.

Деякі дослідження показали, що γ-субодиниця не потрібна для нормального функціонування Na⁺/K⁺-АТФази. Проте, останнім часом було показано, що γ-субодиниці можуть змінювати залежність активації α1/β1-ізоферменту від K⁺-струму при експресії в ооцитах X. leavis [36]. Крім того, виявлено, що γ-субодиниця може стабілізувати E₁ конформацію ферменту та необхідна для кавітації в мишачих ембріонах. Цікаво, що γ-субодиниця належить до родини малих мембранних білків, що беруть участь при проходженні іонів через плазматичну мембрану. Це родина білків, яка здатна індукувати активність іонних каналів при експресії в ооцитах X. leavis. Фізіологічне значення цієї діяльності і чи вимагає воно інших Na⁺/K⁺-АТФазних субодиниць невідомо. Хоча з'являється все більше доказів, що γ-субодиниця може змінити Na⁺/K⁺-помпу. Точна роль субодиниці Na⁺/K⁺-АТФази очікує подальших експериментів [31].

Дата добавления: 2015-07-17