Однонаправленное тандемное расположение генов

Обычно уровень генной экспрессии пропорционален числу копий транскрибируемого гена в хозяйских клетках. Отсюда следует, что с увеличением числа копий плазмиды должно увеличиваться и количество продукта встроенного в эту плазмиду гена. Однако помимо клонируемого гена плазмида содержит и другие транскрибируемые последовательности, например гены устойчивости к антибиотикам, и по мере увеличения ее копийности энергетические ресурсы клетки будут во все большей степени направляться на образование белков, кодируемых плазмидой, и метаболическая активность хозяйской клетки упадет.

Выходом из этой ситуации могло бы стать встраивание в малокопийную плазмиду нескольких копий интересующего исследователя гена. Однако при этом возникает одна техническая проблема — расположение генов в такой ориентации, чтобы все они могли правильно транскрибироваться и транслироваться. Простое сшивание «конец-в-конец» приводит к случайной ориентации генов, так что одни из них экспрессируются, а другие, находящиеся в противоположной ориентации, — нет.

Чтобы решить эту проблему можно использовать рестрицирующий фермент AvaI, который узнает последовательность CTCGGG и разрезает ДНК с 5'-конца от остатка Т.

Плазмиду, содержащую эту последовательность, разрезают с помощью Aval и, используя ДНК-полимеразу I, достраивают липкие концы. Затем к обоим ее тупым концам пристраивают EcoRI -линкер (GAATTC), вновь замыкая кольцо. Получившаяся плазмида содержит сегмент ДНК с двумя AvaI-сайтами, фланкирующими EcoRI-сайт и перекрывающимися с ним. Нужный ген вместе с трансляционными старт-и стоп-сигналами встраивают в EcoRI-сайт и затем вырезают из плазмиды с помощью AvaI. Такие фрагменты имеют неидентичные липкие концы, и поэтому при последующем сшивании соединяются в одной ориентации. Подобный набор однонаправленных тандемных копий гена может быть встроен в экспрессирующий вектор.

Другой подход основан на использовании синтетических ориентированных адаптеров — коротких олигодезоксинуклеотидов, присоединенных к концам линеаризованной плазмидной ДНК и к концам фрагментов ДНК с клонируемым геном. При лигировании эти фрагменты располагаются только в одной ориентации. Описанная процедура технически значительно более проста, чем та, в которой используется рестрицирующая эндонуклеаза AvaI; кроме того, она не требует, чтобы в гене-мишени отсутствовали AvaI- и EcoRI-сайты.

Уже показано экспериментально, что уровень экспрессии генов интерферона действительно увеличивается пропорционально числу тандемных копий гена, по крайней мере до четырех копий на плазмиду. Однако тандемные повторы иногда оказываются нестабильными и со временем некоторые из них или даже все утрачиваются плазмидой.

Дата добавления: 2015-07-07