Методы воссоединения фрагментов ДНК

Наиболее простой и широко применяемый метод соединения фрагментов ДНК — это отжиг фрагментов, полученных после обработки ДНК рестриктазой, образующей «липкие» комплементарные однонитевые, концы, с последующей обработкой ДНК-лигазой. Лигаза катализирует образование фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами, т. е. восстанавливает ковалентную непрерывность цепей ДНК. Наличие «липких» концов не является обязательным условием для воссоединения фрагментов ДНК-лигазой. Так, ДНК-лигаза, кодируемая фагом Т4 (но не лигаза Е. соli), способна соединять и полностью двунитевые фрагменты. Однако, для того чтобы эта реакция протекала эффективно, необходимо наличие высокой концентрации ДНК и значительно большей (приблизительно в 10 раз) концентрации фермента.

Представим ситуацию типичного опыта, при котором смешиваются фрагменты ДНК, полученные из хромосомы Е. соli после обработки крупнощепящей рестриктазой с ДНК плазмиды-вектора, подвергнутого той же обработке. Векторы устроены таким образом, что чаще всего при обработке рестриктазой образуют один линейный фрагмент, зато хромосомная ДНК будет представлена набором приблизительно в 1000 разных фрагментов. При отжиге и лигировании такой смеси образуются не только гибридные молекулы, но и исходные векторы, что затрудняет дальнейшую работу, так как обычно селекция клеток, трансформированных рекомбинантной плазмидой, ведется на первом этапе по маркерам вектора. В этом случае клетки, получившие исходный вектор и рекомбинантную молекулу, неразличимы.

Разработаны специальные методы воссоединения фрагментов ДНК, позволяющие направить процесс преимущественно в сторону получения гибридных молекул.

1. Один из методов основан на расщеплении ДНК вектора несколькими рестриктазами, с тем чтобы уменьшить вероятность самосборки исходного вектора in vitro. Этот метод используется в том случае, когда при расщеплении ДНК вектора нужной рестриктазой образуется несколько фрагментов, не все из которых необходимы для обеспечения жизнеспособности будущей рекомбинантной молекулы.

2. Другой эффективный метод, позволяющий предотвратить воссоединение кольцевой векторной молекулы при обработке ДНК-лигазой, заключается в отщеплении концевых фосфатных групп от линейной ДНК под действием щелочной фосфатазы. Образование ДНК-лигазой кольцевых молекул ДНК in vitro в этом случае возможно только в присутствии фрагментов донорной ДНК, имеющих неповрежденные 5'-фосфатные группы на 5'-концах. В результате создаются гибридные кольцевые молекулы с однонитевыми разрывами в комплементарных нитях ДНК, которые репарируются клеткой in vivo. Метод фосфатазной обработки широко используется при воссоединении фрагментов как по липким, так и по тупым концам.

Часто у экспериментатора возникает потребность клонирования фрагмента ДНК, полученного расщеплением одной рестриктазой, в векторе, имеющем сайт расщепления для другой рестриктазы. С этой целью широко применяются короткие синтетические двуспиральные олигонуклеотиды, имеющие в своем составе сайты узнавания для одной или нескольких рестриктаз. Такие олигонуклеотиды называют линкерами или полилинкерами соответственно.

3. Еще один метод воссоединения фрагментов основан на свойстве фермента — терминальной дезоксирибонуклеотидилтрансферазы — достраивать нуклеотидные последовательности к 3'-ОН-концам фрагментов ДНК (коннекторный метод). Сущность метода заключается в присоединении к концам одного из соединяемых фрагментов ДНК однонитевого полинуклеотида, например поли A (dA), а к другому — комплементарного ему, например поли Т (dT). Достроенные таким образом фрагменты смешивают и отжигают для образования кольцевых структур. Возможные бреши ликвидируют обработкой экзонуклеазой III, ДНК-полимеразой и лигазой, в результате чего получают ковалентно замкнутые кольцевые молекулы.

Основными достоинствами коннекторного метода являются возможность его применения независимо от природы и способа получения фрагментов ДНК и высокий выход рекомбинантных молекул. Важно, что при таком способе воссоединения фрагментов ДНК не могут образоваться исходные кольцевые векторные молекулы.

К недостаткам метода следует отнести трудности, которые возникают при точном вырезании клонированных фрагментов. Кроме того, протяженные гомополимерные участки могут отрицательно влиять на стабильность плазмид из-за внутримолекулярной рекомбинации, а также на экспрессию генов, если она контролируется промотором вектора.

Дата добавления: 2015-07-07